自噬（Autophagy），是指溶酶体中的水解酶非特异地降解细胞质中蛋白质、细胞器等底物的过程，它同时还受复杂信号精细调控，研究比较清楚的有PI3K-I和PI3K-III、mTOR等。 自噬过程一般分为三个阶段： 自噬起始阶段、自噬小体形成阶段、自噬溶酶体阶段。它参与着肿瘤、衰老、炎症、免疫应答、心脑血管疾病、氧化应激、神经退行性疾病、代谢、发育等重要生物学过程。 自噬研究的切入角度： 通常除了研究自噬本身，更多的是把自噬作为一个机制来研究，如自噬如何参与肿瘤的发生发展、自噬如何参与肿瘤的耐药性、自噬如何参与炎症反应、自噬如何参与氧化应激、甚至自噬如何参与自闭症、阿尔兹海默症的发生与治疗等

调控自噬的主要信号通路和相关基因

1、LC3剪切的变化

2、电镜直接观察到自噬囊泡

3、荧光蛋白标记的LC3检测自噬流

衡量自噬的三个“黄金标准”，分别是LC3的翻译后加工及脂化修饰（图A）、利用电镜直接观察自噬小体和自噬溶酶体的多少、荧光蛋白标记的LC3监测自噬流（图B）。

主流自噬示踪工具一：mRFP-GFP-LC3 自噬双标腺病毒（现为mCherry-eGFP-LC3）

双荧光指示体系原理

mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。

我们在显微镜成像后红绿荧光merge后通过merge后出现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱。

如下图:细胞转染mRFP-GFP-LC3病毒后给予氨基酸剥夺处理2小时后出现明显增强的自噬以及自噬流。

红色且没有绿色的斑点代表自噬溶酶体（mRFP），黄色斑点代表自噬小体（RFP+GFP），（由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光）

Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy. 

汉恒客户2017年发表于CELL，IF>30.

主流定位示踪工具二：p62

U2OS用GFP-p62和LC3-RFP同时标记。然后用60 μM 氯喹处理16hr。可以观察到二者有着明显的共定位。（当诱导自噬时，GFP-p62融合蛋白被招募到自噬小体上，呈现绿色小点。如果此时加入氯喹抑制自噬流， 那么GFP-p62就会累积在自噬小体和自噬溶酶体上）

选择性自噬定位工具: Keima探针

Keima探针研究核糖体选择性自噬的基本原理