Cell Met丨TPI1多巴胺化可促进肺再生并抑制肺纤维化！

肺脏位于胸腔内，是人体重要的呼吸器官，在呼吸过程中除了吸入氧气以外，空气中的微生物、有害颗粒等也会随着呼吸进入肺部，这些有害物质可造成肺部损伤，引发各类呼吸系统疾病，其中肺纤维化是多种间质性肺疾病的终末期肺部表现之一，现有的药物无法有效逆转纤维化进程，而促进纤维化肺组织再生有望恢复受损的肺泡和血管结构，为包括肺纤维化在内的多种疾病提供新的治疗策略。接下来，要介绍的这篇文献报道了TGM2（transglutaminase 2，谷氨酰胺转胺酶2）介导的TPI1（Triosephosphate isomerase 1，丙糖磷酸异构酶1）的多巴胺修饰可通过抑制铁死亡促进肺再生的新机制，这对开发抑制肺纤维化进程的治疗靶点具有重要的临床意义。在此研究中，作者使用了汉恒生物提供的VEC血清型+Tie内皮细胞特异性启动子的AAV病毒实现了肺部内皮细胞的特异性基因表达调控。

2024年8月6日，四川大学丁楅森、曹中炜团队和华西医院的叶庭洪、蒲强、张鸣和哈尔滨医科大学的杨力明作为共同通讯作者在《Cell Metabolism》（IF=27.7）发表题为“Dopaminylation of endothelial TPI1 suppresses ferroptotic angiocrine signals to promote lung regeneration over fibrosis ”的研究论文。该研究首先通过构建小鼠肺再生模型和肺内皮Tgm2特异性敲除小鼠并结合单细胞测序分析，发现肺内皮细胞TGM2介导的单胺化可抑制铁死亡进而维持肺再生，随后为研究其具体机制，作者通过体内外实验、化学蛋白质组学、点击化学等技术发现多巴胺能通过TGM2对内皮细胞中的TPI1的Q65位点进行多巴胺化修饰，此修饰可以促进DHAP（dihydroxyacetone phosphate，二羟丙酮磷酸）转化为GAP（glyceraldehyde 3-phosphate，3-磷酸甘油醛）的活性，从而抑制脂质过氧化和铁死亡，促进肺再生。最后，利用临床样本和肺纤维化小鼠模型证实了TPI1多巴胺化对肺纤维化的抑制作用，通过小分子药物pro-DA（propargylated dopamine，丙炔化多巴胺）恢复内皮TPI1多巴胺化水平，能抑制内皮细胞铁死亡，恢复促进再生的血管分泌因子的表达，从而减缓肺纤维化进程，为器官纤维化的治疗提供了新希望。

下面，我们一起来看看本文的主要研究结果吧：

首先，作者建立左肺切除手术（pneumonectomy，PNX）的小鼠模型并进行单细胞测序及WB检测，发现PNX小鼠的TGM2（单胺类神经递质，如多巴胺、血清素等可通过此酶共价修饰蛋白质，此过程称为单胺化） 在肺内皮细胞（Endothelial cell, EC）中选择性上调，提示TGM2依赖性单胺化可能在调节肺血管再生中起重要作用。为了验证这一假设，作者构建了肺EC特异性Tgm2敲除小鼠（Tgm2^{i∆EC/i∆EC}），发现Tgm2^{i∆EC/i∆EC}小鼠在PNX后的肺功能、重量体积均受损，免疫染色和流式细胞术分析表明，PNX后Tgm2^{i∆EC/i∆EC}小鼠肺泡上皮足细胞和EC增殖受阻，纤维组织扩张加剧等，表明EC中TGM2的单胺化对PNX后的肺再生至关重要。为明确TGM2依赖性单胺化调控肺再生的分子机制，作者通过KEGG分析发现铁死亡相关基因在Tgm2^{i∆EC/i∆EC}小鼠中显著富集。铁死亡抑制蛋白1（FSP1）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）是铁死亡的关键抑制因子，FSP1/ GPX4的下调会导致脂质过氧化并引发铁死亡，作者发现FSP1和GPX4在Tgm2^{i∆EC/i∆EC}小鼠的肺EC中表达降低，表明TGM2依赖性单胺化可以抑制肺再生过程中EC的铁死亡。然后，作者将内皮特异性过表达FSP1的AAV-VEC-Tie-Fsp1病毒注射到Tgm2^{i∆EC/i∆EC}小鼠肺中，以恢复肺内皮Fsp1的表达，发现可逆转Tgm2^{i∆EC/i∆EC}小鼠被抑制的肺再生。为测试铁死亡对TGM2阻断引起的肺再生的抑制作用，作者在小鼠EC中敲入Gpx4，经TGM2抑制剂（TGM2i）处理的Gpx4 EC敲入小鼠在PNX治疗后，肺功能、肺泡结构和细胞繁殖的恢复能力均增强。这些结果表明，肺EC中TGM2依赖性单胺化可通过抑制铁死亡而维持肺再生。

图1. 内皮细胞TGM2通过抑制铁死亡维持肺再生

作者为了揭示TGM2介导的神经递质修饰在EC中的抗铁死亡作用。使用不同的神经递质处理人脐静脉内皮细胞（HUVEC），发现只有多巴胺能显著抑制铁死亡，此外，使用TGM2i处理能够消除多巴胺对铁死亡的抑制作用及对GPX4的上调作用，表明多巴胺的抗铁死亡功能依赖于TGM2介导的多巴胺化修饰。由于多巴胺的生物合成需要3,4-二羟基苯丙氨酸脱羧酶（DDC），因此，作者使用了DDC缺失的小鼠模型探究多巴胺对肺再生的作用，发现DDC单倍体缺失小鼠在PNX模型中表现出肺功能、重量、体积和肺泡结构的恢复受阻，上皮细胞和EC增殖受阻以及纤维组织过度扩增等问题。为筛选EC中的多巴胺化蛋白，作者通过化学蛋白质组学、点击化学技术并与液相色谱-串联质谱分析相结合，鉴定出TPI1是TGM2介导的多巴胺化靶标之一。为检测内皮TGM2是否介导了TPI1多巴胺化，作者发现Tgm2^{i∆EC/i∆EC}小鼠的肺EC中，TPI1的多巴胺化消失，表明体内TPI1的多巴胺化依赖于EC表达的TGM2。随后，作者通过体外和体内实验分别研究了TPI1对铁死亡的作用，发现敲低HUVEC中的Tpi1阻断了多巴胺抑制铁死亡和上调GPX4的作用，而过表达Tpi1可保护HUVEC免受铁死亡影响。在体内实验中，作者使用AAV-VEC-Tie-shTpi1特异性敲低肺EC中的Tpi1后（Tpi1^{EC KD}），向小鼠注射pro-DA，发现AAV-VEC-Tie-shTpi1抑制了PNX后肺功能的恢复以及肺中的细胞繁殖。而注射pro-DA 会增强了Gpx4^{i∆EC/i∆EC} 小鼠的肺再生能力，但Tgm2^{i∆EC/i∆EC}小鼠没有改善。综上所述，TPI1作为TGM2介导的多巴胺化靶点抑制肺再生EC中的铁死亡。

图2. TPI1是TGM2介导的多巴胺化靶标，可抑制再生肺内皮细胞中的铁死亡

接着，作者继续探究了TPI1调控铁死亡的具体机制。作者发现恢复肺EC中FSP1的表达可逆转肺切除Tpi1^{EC KD}小鼠受损的肺再生能力，且内皮细胞和肺泡上皮祖细胞增殖增强，纤维扩增减少，EC选择性敲入GPX4可以改善Tpi1^{EC KD}小鼠肺再生，这些发现表明TPI1的多巴胺化抑制ECs中的铁死亡以维持肺再生。随后，作者发现多巴胺能够增加TPI1催化DHAP转化为GAP的活性，而其他神经递质则没有此作用，TGM2i或多巴胺合成抑制剂可以减弱这种转化作用。因此，作者假设TGM2对TPI1的多巴胺化作用介导了将DHAP转化为GAP的酶活性变化，并调节醚类磷脂的合成。作者通过对肺内皮细胞进行脂质组学分析，发现TGM2i增强了磷脂、磷脂酰胆碱及相关醚磷脂的生成，TPI1在HUVEC中的敲低也增加了醚磷脂的产生，这些磷脂在脂质过氧化后会引发铁死亡。此外，Tpi1^{EC KD}小鼠在肺内皮细胞中表现出更高的脂质过氧化相关的铁死亡水平，而这种铁死亡可以通过过表达Fsp1逆转，这些结果表明，TPI1的多巴胺化调节醚磷脂的产生，以防止PNX后脂质过氧化和铁死亡。

图3. TPI1的多巴胺化调节醚磷脂合成，以调节再生肺内皮细胞中的脂质过氧化和铁死亡

由于蛋白质中的谷氨酰胺（Q）已被证明是TGM2的转氨位点，因此，作者使用LC-MS/MS分析了TPI1中谷氨酰胺残基的修饰情况，结果显示，在TGM2存在的情况下，TPI1通过Q65残基被多巴胺化修饰，在Q65处观察到分子量改变，将TPI1中的Q65突变为谷氨酸会阻断TGM2对其进行多巴胺化修饰，此结果表明，多巴胺共价修饰了TPI1的Q65残基，进而增强了其将DHAP转化为GAP的活性。为验证Q65多巴胺化的TPI1对肺的保护作用，作者纯化出了能特异性识别Q65多巴胺化TPI1的多克隆抗体，WB分析显示，在肺切除的Tgm2^{i∆EC/i∆EC}小鼠的肺EC细胞中，Q65位点的TPI1多巴胺化被消除。作者把TPI1的Q65残基突变为谷氨酸（Tpi1^{EC Q65E}）来研究Q65多巴胺化TPI1的体内功能，作者将AAV-VEC-Tie-shTpi1和AAV-VEC-Tie-Q65E Tpi1共同注射到小鼠肺中，WB分析显示，在PNX后，Tpi1^{EC Q65E}小鼠肺EC中TPI1的Q65多巴胺化修饰被消除，同时肺泡再生被抑制，肺纤维扩张增强。综上所述，肺内皮细胞TPI1中Q65多巴胺化避免了脂质过氧化和铁死亡，从而维持了肺再生。

图4. TPI1中Q65的多巴胺化修饰可减少促纤维化的铁死亡并促进肺再生

随后，作者对Q65多巴胺化修饰影响TPI1催化活性和方向的机制进行了探究。作者发现，Tpi1^{EC Q65E}小鼠在PNX后，肺EC中DHAP生成增加，GAP生成减少，同时糖酵解减少，与铁死亡相关的磷脂过氧化作用增强，表明TPI1中Q65的多巴胺化选择性地提高了其将脂质前体DHAP转化为糖酵解组分GAP的活性，从而平衡了脂质和葡萄糖代谢。接着，作者采用分子动力学模拟方法分析发现TPI1中Q65的多巴胺化会导致TPI1的构象变化，从而加强了催化残基与DHAP而非GAP的接触，与未修饰的TPI1相比，多巴胺化后的TPI1与DHAP的距离更短，尤其是催化残基H96和K14与DHAP之间的距离缩短，相比之下，催化残基与GAP之间的距离不受多巴胺化的影响，此外，多巴胺化还优化了催化残基E166相对于DHAP的角度，使得E166的位置更加有利于催化DHAP。综上表明，多巴胺化TPI1的构象变化优化了TPI1与DHAP的相互作用，减少了与GAP的相互作用，这有助于促进糖酵解并减少脂质过氧化，平衡了脂质/葡萄糖代谢，最终抑制铁死亡，促进肺再生。

图5. TPI1中Q65残基的多巴胺化增强了其催化残基与DHAP而非GAP之间的接触，引导酶促反应将DHAP转化为GAP

由于阻断肺EC中的TPI1多巴胺化会增加纤维扩张，作者评估了TPI1多巴胺化在肺再生中的抗纤维化作用。发现PNX后，Tgm2^{i∆EC/i∆EC}小鼠肺胶原沉积和纤维反应增强，Tpi1^{EC KD}小鼠肺纤维化反应增强，而内皮细胞过表达Fsp1则使Tpi1^{EC KD}肺纤维化反应减弱。由于血管内皮细胞会产生多种旁分泌因子与血管周围细胞相互作用，因此，作者检测了PNX后Tgm2^{i∆EC/i∆EC}和Tpi1^{EC KD}小鼠肺EC中旁分泌因子的分化表达，其中肝细胞生长因子（HGF）是肺EC中分化程度最高的基因，PNX后，Tgm2^{i∆EC/i∆EC}和Tpi1^{EC KD}小鼠肺EC中HGF蛋白减少，肺内皮细胞中HGF的产生已被证明可刺激上皮细胞增殖并阻断纤维活化。为了检测HGF的作用，作者使用了Tgm2^{i∆EC/i∆EC}和Tpi1^{EC KD}小鼠的肺切片进行体外培养，发现培养基中的HGF蛋白水平下降，而在培养基中添加HGF可增加肺泡上皮祖细胞的增殖，并减弱了纤维化。这些结果表明，阻断再生肺内皮细胞中TPI1多巴胺化可诱导铁死亡，并重新编程内皮旁分泌因子/血管分泌因子如HGF的产生。

图6. 阻断EC中的TPI1多巴胺化会增强PNX后小鼠肺部的纤维化反应

由于阻断内皮TPI1的Q65残基多巴胺化会增强PNX后的纤维激活，作者进一步评估了Q65多巴胺化的TPI1在肺纤维化患者和小鼠肺纤维化模型中的作用。在肺纤维化患者的样本中，通过单细胞RNA测序分析，发现TGM2在纤维化肺内皮细胞中的表达减少，且与肺功能指标的恶化相关联，Q65多巴胺化的TPI1量也有所降低。在小鼠肺纤维化模型中，肺EC中TGM2和Q65多巴胺化的TPI1均降低，这些数据表明，TPI1的Q65位点经TGM2多巴胺化后可减轻肺纤维化。然后，作者在肺纤维化小鼠模型中检测Tgm2^{i∆EC/i∆EC}和