自噬的分类及其研究方法

自噬最早于1962年由Ashford 和 Porter两位学者提出，是细胞在自噬相关基因(autophagy related gene，Atg)的调控下利用溶酶体降解自身的细胞器和大分子物质的过程，是真核细胞特有的生命现象。

根据底物进入溶酶体途径的不同，可将自噬分为大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬（CMA）。由脂质膜结构包绕带降解物形成自噬体，然后与溶酶体融合并降解其内容物的过程称为大自噬，即我们通常所说经典自噬。小自噬也发生相同的包绕过程，但包绕底物的是自身发生内陷的溶酶体膜。CMA是指胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中并消化的过程，CMA在清除蛋白质是有选择性，底物为可溶的蛋白分子[1]。

图1 大自噬、小自噬、CMA图解

经典自噬研究思路

一个清晰的研究思路是做研究的第一步，也是非常关键的一环，明确研究思路之后设计实验方案或是查找参考文献才能事半功倍，自噬研究的常用思路可参考下图。

图2 自噬研究的思路

自噬监测的黄金标准：

1、LC3剪切的变化

2、电镜直接观察到自噬囊泡

3、荧光蛋白标记的LC3监测自噬流

衡量自噬的三个“黄金标准”，分别是LC3的翻译后加工及脂化修饰（图A）、利用电镜直接观察自噬小体和自噬溶酶体的多少、荧光蛋白标记的LC3监测自噬流（图B）。

汉恒生物主流自噬示踪工具

mRFP-GFP-LC3 自噬双标腺病毒（现为mCherry-eGFP-LC3）

mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。

我们在显微镜成像后红绿荧光merge后通过merge后出现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱。

如下图:细胞转染mRFP-GFP-LC3病毒后给予氨基酸剥夺处理2小时后出现明显增强的自噬以及自噬流。

分子伴侣介导的自噬

什么是分子伴侣介导的自噬（CMA）

分子伴侣介导的自噬主要通过分子伴侣识别蛋白质序列上的一段特殊基序，将蛋白转运到溶酶体内进行降解的过程。其大致流程见图1：Ⅰ、分子伴侣热休克同源蛋白70（HSC70）识别带有KFERQ基序的底物；Ⅱ、HSC70-底物复合体与溶酶体相关膜蛋白2A型（LAMP2A）相结合；Ⅲ、分子伴侣对底物进行去折叠，形成CMA易位复合体；Ⅳ、LAMP2A多聚化介导的底物易位，溶酶体蛋白酶对底物进行降解，LAMP2A从易位复合体中解离。

图1 分子伴侣介导的自噬模式图

通常情况下，肝脏、肾脏、大脑等组织或培养物中的几乎所有不同细胞类型中均可以检测到一定程度的CMA活性，而细胞应激状态下则最大程度地激活了这一途径，饥饿、氧化剂、促氧化剂和蛋白质变性毒素均会引起CMA的活化。CMA通过选择性识别和降解细胞过程中的某些蛋白，对细胞活动做到精确调控，其潜在功能研究也逐渐成为自噬研究的热点。