IF=14.7| Parkin有望成为铁过载导致的心肌损伤的“救星”

2025年1月，青岛大学的王建勋教授团队在《Acta Pharmaceutica Sinica B》期刊上发表了题为“Parkin inhibits iron overload-induced cardiomyocyte ferroptosis by ubiquitinating ACSL4 and modulating PUFA-phospholipids metabolism（Parkin通过泛素化ACSL4和调节PUFA -磷脂代谢抑制铁过载诱导的心肌细胞铁死亡）”的研究论文。研究中使用了汉恒生物提供的自噬双标腺病毒以研究Parkin对心肌细胞线粒体自噬的影响。

铁是一种不可或缺的微量元素，在能量代谢、核苷酸合成和DNA修复等多种生物过程中起着至关重要的作用，体内铁平衡紊乱可导致各种心血管疾病。铁过载可通过诱导氧化应激和脂质过氧化增加心血管疾病的风险，然而其具体作用机制尚不清楚。Parkin（PARK2）最初被确定为帕金森病相关基因，有研究发现糖尿病性心肌病、心肌老化、心脏肥厚等心脏疾病中，心肌细胞中Parkin的表达水平下调。因此，研究人员认为Parkin可能参与铁过载引发的心血管疾病。

铁过载与心脏病密切相关。铁死亡是心肌缺血再灌注（I/R）损伤中新发现的一种细胞死亡形式。然而，心脏铁过载引起心肌损伤的具体分子机制，以及铁死亡在铁过载引起的心肌损伤中的作用尚不清楚。本研究发现铁死亡参与铁过载和I/ R诱导的心肌病的发展。机制上，Parkin通过促进ACSL4（参与铁死亡相关脂质代谢途径的关键蛋白）的泛素化来抑制铁过载诱导的心肌细胞铁死亡，而转录因子p53可抑制铁过载心肌细胞中的Parkin表达，从而调节铁死亡。铁死亡抑制剂Fer-1可显著抑制铁过载诱导的铁死亡和心肌I/R损伤。此外，Parkin可有效保护线粒体功能，防止铁过载引起的线粒体脂质过氧化。研究结果表明p53 - Parkin- ACSL4信号通路通过抑制铁死亡减轻心脏疾病。

图1. p53 - Parkin - ACSL4信号轴调控铁死亡示意图

1. 铁过载诱导心肌细胞铁死亡，并促进体外缺氧复氧（H/R）引发的细胞死亡

首先作者使用铁铵柠檬酸盐（FAC）处理H9C2细胞和新生大鼠心肌细胞，发现随FAC浓度增加，细胞铁含量升高，死亡数量增加，脂质过氧化产物MDA的含量和铁死亡分子标记物Ptgs2的表达均显著上升（图2A-E）。接着，作者采用多种死亡抑制剂处理铁过载的心肌细胞（指新生大鼠和小鼠心肌细胞，下文统称为心肌细胞），结果显示只有铁死亡抑制剂（Fer-1）可逆转细胞死亡，而坏死凋亡抑制剂（Nec-1）和凋亡抑制剂（ZVAD）没有显著减轻细胞死亡或脂质过氧化（图2F-H）。这些数据表明，铁过载主要通过铁死亡途径诱导心肌细胞死亡。

H/R处理心肌细胞会导致其铁水平升高（图2I），使用低浓度FAC（25 μmol/L）进一步处理心肌细胞，细胞死亡增加，MDA浓度升高，而Fer-1处理可显著减轻这些影响（图2J和K）。以上结果表明，抑制铁死亡可减轻H/R诱导的细胞损伤。

图2.铁过载诱导心肌细胞铁死亡，并促进H/R引发的细胞死亡

2. Parkin对铁过载所致铁死亡的体外抑制作用

先前有研究表明心脏疾病中心肌细胞中Parkin的表达水平下调，然而Parkin是否参与铁过载诱导的心肌细胞铁死亡尚不清楚。于是作者先测量了高浓度FAC（100 μmol/L）处理的心肌细胞和高铁饮食（HID）喂养小鼠心脏中的Parkin含量，体内外实验均显示相比对照组，铁过载组Parkin表达水平下降（图3A-C）。在高浓度FAC处理的心肌细胞中过表达Parkin可减少细胞死亡，同时降低MDA含量（图3E-G）。另外，作者发现FAC处理后心肌细胞中铁死亡相关蛋白表达量发生变化，TFR1、ACSL4表达升高，GPX4表达降低，而Parkin过表达可以抑制ACSL4的表达，但对TFR1和GPX4没有影响（图3H）。作者通过敲低Parkin进一步研究其对低浓度FAC处理的心肌细胞的影响，发现Parkin沉默会加重细胞铁死亡（图3J和K）。

图3. Parkin抑制由铁过载引起的铁死亡

3. Parkin抑制铁过载引起的线粒体功能障碍

由于线粒体ROS过量产生会引起脂质过氧化进而导致铁死亡，于是作者进一步探究铁过载对心肌细胞线粒体功能的影响，以及Parkin在其中的作用。使用高浓度FAC处理心肌细胞，作者发现线粒体铁含量增加，线粒体膜电位、线粒体ATP和线粒体耗氧量显著降低，线粒体脂质ROS和线粒体ROS增加，而过表达Parkin或者使用Fer-1处理可逆转上述效应（图4A-F），表明Parkin可减轻铁过载引起的线粒体损伤。使用汉恒生物的自噬流检测腺病毒ADV-RFP-GFP-LC3感染心肌细胞，同时使用mitoSOX定位线粒体，检测线粒体自噬水平，发现FAC处理后显著降低了细胞线粒体自噬，过表达Parkin则能够恢复细胞自噬（图4G-H）。以上结果表明，Parkin在细胞铁过载的情况下能够刺激线粒体自噬，这可能有助于其对铁过载心肌细胞的保护作用。

图4. Parkin抑制铁过载引起的线粒体损伤

4. Parkin调节铁过载诱导的脂质过氧化

铁死亡由脂质过氧化引起，含有多不饱和脂肪酸（PUFA）的磷脂极易氧化，因此作者推测Parkin是通过调节脂质代谢来抑制铁死亡的。作者首先对FAC处理的心肌细胞进行了脂质组学分析，发现与正常心肌细胞相比，FAC处理的心肌细胞中磷脂酰乙醇胺（PE）浓度升高，而其他磷脂包括磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰丝氨酸（PS）和或磷脂酰肌醇（PI）浓度无明显变化，Parkin过表达可有效抑制铁过载导致的PE浓度升高（图5A-B）。接着，作者通过在细胞中添加PUFA（二十碳四烯酸，C20:4；二十二碳六烯酸，C22:5；和二十二碳六烯酸，C22:6）验证其诱导心肌细胞铁死亡的潜力，发现单独添加PUFA脂质过氧化产物MDA含量几乎无变化，而在FAC处理的心肌细胞中添加PUFA可导致MDA含量显著上升，在其基础上过表达Parkin后MDA含量下降。基于以上结果，作者认为Parkin可能是通过调节心肌细胞磷脂中PUFA来抑制铁过载引起的铁死亡。

图5. Parkin调节脂质代谢

5. Parkin通过ACSL4调节细胞代谢抑制铁死亡

先前有研究显示ACSL4通过优先氧化PE调节脂质合成，于是作者推测Parkin可能通过靶向ACSL4调控PE中PUFA的含量。通过脂质组学分析，作者发现ACSL4的敲低抑制了铁过载引起的PE的增加（图6A），PE中PUFAs （C20:4、C22:5和C22:6）的水平也显著降低（图6B）。通过检测高浓度FAC处理的心肌细胞中的ACSL4含量，发现其蛋白水平随铁过载时间增加而上升（图6C），沉默ACSL4显著抑制铁诱导的细胞死亡（图6E）和脂质过氧化（图6F）。接着，作者通过在心肌细胞中过表达Parkin研究其与ACSL4的联系，结果显示Parkin过表达后ACSL4的表达下降（图6G）。在FAC处理的心肌细胞中过表达Parkin后细胞死亡减少，MDA含量下降，而过表达ACSL4则显著减弱了这些效应（图6H-J）。以上结果表明，Parkin通过靶向ACSL4调节铁诱导的脂质代谢。

图6. Parkin通过ACSL4调节细胞代谢抑制铁死亡

6. Parkin与ACSL4结合并催化其泛素化

确定了Parkin的靶点，作者开始进一步探究Parkin作用于ACSL4的分子机制。通过免疫沉淀和表面等离子体共振实验作者确认Parkin和ACSL4直接相互作用（图7A-D）。有研究显示Parkin在泛素蛋白酶体依赖途径中作为E3泛素蛋白连接酶，作者分别在H9C2细胞和293T细胞中进行内源性和外源性泛素化实验，结果显示Parkin可增强ACSL4的泛素化和降解（图7E-F）。另外，作者发现Parkin通过野生型或K48泛素使ACSL4多聚泛素化（图7G）。这些结果表明，Parkin与ACSL4结合并通过K48连接的泛素链诱导ACSL4的多聚泛素化。

图7. Parkin与ACSL4结合并催化其泛素化

7. p53靶向Parkin调节铁过载诱导的铁死亡

p53是最常见的转录因子，有研究报道p53可以调控Parkin的表达。为了确定Parkin是否是p53的转录调控靶点，作者首先利用网站预测分析小鼠、人类和大鼠p53与Parkin启动子区域的结合位点，发现Parkin启动子区域包含一个最佳p53结合位点（图8A）。此外，ChIP实验也证实了p53与Parkin启动子区结合（图8B），表明p53在转录水平上调控Parkin。为了确定p53在铁过载诱导的铁死亡中的作用，作者使用FAC处理心肌细胞，观察到p53 mRNA水平和蛋白水平均明显上升（图8C-E）。p53过表达能够降低Parkin mRNA水平（图8F-H）。此外，p53敲低抑制FAC诱导的细胞死亡和脂质过氧化，但当Parkin同时被敲低时，这些作用被逆转（图8I-K）。这些结果表明p53通过调节Parkin的转录促进铁过载诱导的心肌细胞铁死亡。

图8. p53靶向Parkin调节铁过载诱导的铁死亡

8. 铁过载的Myh6-CreERT2/Parkinfl/fl小鼠表现出组织铁死亡和心肌损伤水平升高

在体外实验确认Parkin抑制铁死亡的作用机制后，作者进一步利用体内实验进行验证。作者培育了Myh6-CreERT2/Parkinfl/fl小鼠，并在小鼠6周龄时，连续7天向Myh6-CreERT2/Parkinfl/fl小鼠腹腔注射他莫昔芬，特异性敲除小鼠心脏的Parkin基因后进行后续实验。高铁饮食喂养六周诱导铁过载，结果显示，与常规饮食的小鼠相比，高铁饮食的普通小鼠Parkin蛋白水平较低，ACSL4泛素化水平降低，另外Myh6-CreERT2/Parkinfl/fl小鼠（心脏特异性Parkin敲除小鼠）也检测出ACSL4泛素化水平降低（图9A-B）。高铁饮食组心肌细胞死亡增加，Ptgs2表达量和MDA含量均有所增加，Myh6-CreERT2/Parkinfl/fl小鼠心肌细胞铁死亡比高铁饮食组更为严重（图9C-G）。作者提取了Myh6-CreERT2/Parkinfl/fl小鼠的心肌细胞，在细胞中过表达Parkin，发现Parkin的重新表达可促进ACSL4泛素化，抑制铁死亡。以上结果再次证明了Parkin通过ACSL4影响铁死亡。

图9. 铁过载的Myh6-CreERT2/Parkinfl/fl小鼠表现出组织铁死亡和心肌损伤水平升高

9. Fer-1和Parkin可减轻I/R诱导的心肌损伤

作者以C57BL/6小鼠为实验对象进一步探讨铁死亡在心脏I/R损伤中的作用。小鼠高铁饮食六周并进行I/R手术，此外，部分小鼠在I/R手术前一天注射铁死亡抑制剂Fer-1（图10A）。结果显示高铁饮食小鼠与标准饮食小鼠相比，心肌梗死区域增加，注射Fer -1梗死区域减小（图10B-C）。此外，与假手术组相比，I/R处理组心肌铁含量、心肌细胞死亡百分比、Ptgs2 mRNA和MDA水平均有所增加，而在小鼠心脏I/R损伤期间向小鼠注射Fer-1可减少铁死亡，可减轻以上变化（图10D-G）。

此外，作者还构建了Parkin过表达小鼠来研究Parkin对I/R诱导的铁死亡和心肌损伤的影响，发现Parkin的过表达有效地抑制了I/R诱导的铁死亡和心肌损伤（图10I-O）。这些结果表明，使用铁死亡抑制剂Fer-1或过表达Parkin均改善I/R诱导的铁死亡和心肌损伤。

图10. Fer-1和Parkin可减轻I/R诱导的心肌损伤

综上所述，研究揭示了p53-Parkin-ACSL4的铁死亡通路，p53转录抑制Parkin的表达，从而抑制Parkin对ACSL4的泛素化，诱导心肌细胞发生铁死亡，最终损害心脏功能。该研究结果为预防心血管疾病提供了新的策略。