APSB(IF=14.7) | UDP-G/P2Y14R轴：急性肝衰竭中肝脏再生的调控密码

急性肝衰竭（ALF）是一种罕见病症，表现为肝功能迅速出现异常，且病情不断发展、恶化，其特征为凝血功能障碍和肝性脑病，具有很高的死亡率。细菌侵袭、病毒感染、药物、毒素等因素作用下可能会引起ALF的发生。此外，ALF也是肝切除术后的致命并发症之一。除肝移植外，ALF仍缺乏有效的治疗策略。尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-G）已被发现可促进肝脏修复，但关于UDP-G及其受体P2Y14R在ALF中的作用仍不明确。

2025年1月19日，中国药科大学胡庆华教授团队在Acta Pharmaceutica Sinica B（IF：14.7）杂志发表了题为《P2Y14R activation facilitates liver regeneration via CREB/DNMT3b/Dact-2/β-Catenin signals in acute liver failure》的研究论文。该研究报道了P2Y14R依赖CREB/DNMT3b/Dact-2/β-Catenin信号通路调节肝脏再生，缓解ALF的机制：即P2Y14R可通过肝细胞中CREB/DNMT3b信号通路调节Dact-2甲基化，抑制Dact-2的表达；而Dact-2可稳定β-Catenin降解复合体，其表达受抑制会使β-Catenin介导的肝脏再生被激活。且体内研究发现，对肝细胞癌（HCC）模型小鼠外源性补充UDP-G，可促进其部分肝切除术后肝功能的恢复，并延长其生存期。该研究论文揭示了P2Y14R在ALF中对肝脏再生的关键调控作用，为治疗ALF提供了一种潜在策略。

文章使用了汉恒AAV8-shDact2用于敲低大鼠肝脏Dact2基因

1. P2Y14R不足可通过抑制肝脏再生通路加剧ALF

为探究P2Y14R在ALF中的调节作用，作者结合GEO数据库分析发现P2Y14R在硫代乙酰胺（TAA）诱导或部分肝切除诱导的ALF中均表达升高（图1A）。接着作者在P2Y14R基因全身敲除（P2Y14R-/-）的大鼠上进行TAA诱导ALF（图1B），检测不同时间节点UDP-G的变化，发现UDP-G含量显著增加，并在48小时达到峰值（图1C）。且相对于野生组（WT组），P2Y14R-/-大鼠肝脏中丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平显著上升（图1D和E）。WT大鼠注射TAA 24h后，肝细胞坏死、肝索排列紊乱，同时伴有单核细胞和红细胞轻度浸润，48h后损伤程度达到峰值，72h后炎症浸润逐渐减少，且7天后完全修复。但P2Y14R的敲除加剧了TAA诱导的肝损伤（图1F）。随后，作者进一步研究P2Y14R敲除对肝脏代偿性再生的影响。在TAA诱导24h后，WT大鼠肝脏再生相关蛋白β-Catenin、p-GSK3β、c-Myc和CyclinD1的表达开始升高，并且在48h和72h内维持高水平。但其在P2Y14R-/-大鼠肝脏中的表达降低（图1G）。此外，免疫荧光也证实了β-Catenin的表达情况（图1H）。以上结果表明，P2Y14R基因敲除通过抑制β-Catenin介导的肝脏再生并延缓肝脏损伤修复来加剧TAA诱导的ALF。

图1. P2Y14R敲除通过抑制β-Catenin信号通路加重TAA诱导的ALF

2. P2Y14R不足通过抑制肝脏再生加重70%肝切除术后的ALF

为了研究P2Y14R是否对肝脏再生有直接影响，作者分别对WT、P2Y14R+/-和P2Y14R-/-大鼠进行了70%肝切除术（图2A）。检测发现与WT大鼠组相比，P2Y14R+/-和P2Y14R-/-大鼠组血清ALT和AST水平显著升高（图2B），肝脏再生率降低（图2C），且肝脏中Ki67阳性细胞也显著减少（图2D）。此外，P2Y14R-/-大鼠组在肝切除术后活性β-Catenin（非磷酸化，N-P-β-Catenin）、β-Catenin、p-GSK3β、CyclinD1和c-Myc的蛋白表达水平均降低（图E）。以上结果进一步说明P2Y14R的全身性敲除可通过抑制β-Catenin介导的肝脏再生通路加重ALF。

图2. P2Y14R不足抑制部分肝切除术后的肝脏再生

3. 在大鼠70%肝切除模型中，P2Y14R依赖Dact-2调节肝脏再生

为阐明P2Y14R调控肝脏再生的机制，作者对70%肝切除术后的WT和P2Y14R -/-大鼠进行了RNA测序。发现Dact-2在WT和P2Y14R -/-大鼠之间存在显著差异（图3A），且在P2Y14R -/-大鼠肝脏中，WB和免疫荧光结果均显示Dact-2的表达显著增加（图3B和C）。为探究P2Y14R对肝细胞再生调控是否依赖于Dact-2，作者对P2Y14R-/-大鼠注射AAV8-shDact2（汉恒生物提供）构建Dact-2基因敲低模型。4周后，Dact-2蛋白表达显著下调（图3D和E）。与对照组相比，Dact-2敲低组肝脏再生率提高（图3F），Ki67以及 N-P-β-Catenin、β-Catenin 、p-GSK3β和cyclinD1的表达也显著增加（图3G-J）。上述结果表明，Dact-2在P2Y14R介导的肝脏再生调控中发挥关键作用。

图3. 在70%肝切除模型中，P2Y14R依赖Dact-2调控肝脏再生信号

4. 肝细胞特异性敲除P2Y14R抑制肝脏再生

肝脏再生涉及多种细胞，包括肝星状细胞和肝细胞。因此作者利用肝星状细胞P2Y14R特异性敲除（P2Y14Rflox/floxLratcre/+）小鼠和肝细胞P2Y14R特异性敲除（P2Y14Rflox/floxAlbcre/+）小鼠研究部分肝切除术后肝脏再生情况（图4A）。观察发现，与WT小鼠相比，P2Y14R-/-小鼠的肝脏再生速率降低（图4B）；P2Y14Rflox/floxLratcre/+小鼠与P2Y14Rflox/flox小鼠相比，肝脏再生速率没有显著差异（图4C）。由于P2Y14Rflox/floxAlbcre/+小鼠70%肝切除术后在24h死亡率达到100%，因此采用30%和50%肝切除术（图4D）。与P2Y14Rflox/flox小鼠相比，P2Y14Rflox/floxAlbcre/+小鼠的肝脏再生速率较低（图4E）。接着作者检测了部分肝切除术后相关蛋白的表达情况，与P2Y14Rflox/flox小鼠相比，P2Y14Rflox/floxAlbcre/+小鼠中p-GSK3β、c-Myc、CyclinD1和 N-P-β-Catenin的表达显著降低，Dact-2表达显著升高（图4F-I）。免疫荧光结果也显示P2Y14Rflox/floxAlbcre/+小鼠中N-P-β-Catenin和β-Catenin表达降低，Dact-2表达升高（图4J）。这些数据证实了肝细胞中P2Y14R通过Dact-2对β-Catenin的干预，来调控ALF后的肝脏再生。

图4. 肝细胞特异性敲除P2Y14R可抑制部分肝切除术后的肝脏再生

5. UDP-G激活P2Y14R以依赖DNMT3b的方式调节Dact-2的甲基化水平

接着作者对P2Y14R调控Dact-2的机制进行了探究。检测发现在体外实验中，20 umol/L的UDP-G刺激可使LO-2和HepG2显著增殖（图5A），因此，选择此浓度用于后续给药。由于Dact-2启动子甲基化可使其表达下调，因此，作者研究P2Y14R是否调控Dact-2的甲基化。通过MethPrimer软件预测Dact-2启动子区域的CpG岛并设计引物，检测发现Dact-2启动子在人肝癌细胞系（SNU182，HepG2和SMMC-7721）中高度甲基化，而在LO-2中未发生甲基化（图5B）。但在P2Y14R过表达的LO-2中，Dact-2启动子甲基化水平显著升高（图5C）。DNMT可催化并维持甲基化，利用两种DNMT广谱抑制剂地西他滨（decitabine）和SGI-1027均可降低UDP-G刺激引起的LO-2细胞增殖（图5D）。在UDP-G刺激48h后检测DNMT各亚型mRNA表达显示，DNMT3b的表达显著增加（图5E）。DNMT3b的选择性抑制剂七尾霉素（Nanaomycin A）可显著抑制LO-2细胞的增殖，而DNMT3a和DNMT1的选择性抑制剂γ-谷维素（γ-oryzanol）无明显抑制作用（图5F）。为探究DNMT3b的上游分子机制，作者使用GTRO、UCSC和JASPAR网站预测到了7个与DNMT3b启动子结合的潜在转录因子（图5G）。由于作者前期研究中发现CREB是中性粒细胞中因P2Y14R缺失而激活的cAMP/PKA信号的下游通路。因此，作者利用JASPAR（阈值分数97.0）预测了CREB与DNMT3b的结合（图5H），并进行ChIP实验加以证实（图5I）。综上所述，在肝细胞中，UDP-G激活P2Y14R可介导CREB，CREB调控DNMT3b的表达，进而增加Dact-2的甲基化。

图5. UDP-G激活P2Y14R，以依赖DNMT3b的方式调节Dact-2的甲基化水平

6. 在HCC模型中，UDP-G处理有助于肝切除术后肝功能的恢复并延长总生存期

肝切除术是治愈HCC的最佳方法，因此作者进一步探究了激活P2Y14R在HCC肝切除术后早期阶段的作用。对HCC小鼠模型在第14天进行部分肝切除术，并通过皮内注射15 mg/kg的UDP-G，在第16天处死动物（图6A）。观察发现UDP-G处理组小鼠肝脏再生率高于对照组（图6B），且ALT、AKP（碱性磷酸酶）和DBIL（直接胆红素）水平均显著下调，AST水平无变化（图6C）。之后，作者对TCGA的RNA-seq数据进行了分析，并通过Kaplan-Meier Plotter分析了P2Y14R表达与临床之间的相关性。P2Y14R高表达的HCC患者，其总生存期、无进展生存期、无复发生存期和疾病特异性生存期均显著延长（图6D）。这些结果表明，UDP-G治疗可促进早期HCC术后恢复过程中的肝脏再生并改善肝损伤。接着，作者研究了UDP-G治疗是否会影响肝癌（HCC）小鼠的总体生存率和肿瘤大小（图6E）。分别皮内注射15 mg/kg和30 mg/kg的UDP-G对小鼠进行治疗，发现UDP-G显著延长了小鼠的总体生存期（图6F）。活体成像（VIS imaging）显示UDP-G治疗的小鼠与对照组小鼠的肿瘤大小并无显著差异（图6G）。综上结果表明，UDP-G治疗可延长小鼠的总体生存期，但不影响肿瘤大小。

图6. 在HCC模型中，UDP-G治疗能够促进肝切除术后早期肝功能的恢复

综上，该研究揭示了ALF中UDP-G/P2Y14R轴调控肝脏再生的机制：在ALF中，UDP-G激活 P2Y14R后可通过CREB介导DNMT3b的表达，进而促进Dact-2的甲基化，增加β-Catenin的表达，从而促进肝脏再生并缓解ALF。此外，外源性UDP-G可以加速HCC小鼠部分肝切除术后的肝脏再生，延长总生存期。因此，开发长效P2Y14R激动剂或外源性补充UDP-G可作为治疗ALF的潜在药物。

图7. UDP-G/P2Y14R轴调控肝脏病理过程示意图