分子克隆-无缝克隆原理与传统酶连法的区别

2025.07.09 浏览量：来源：汉恒生物

无缝克隆原理与传统酶连法的区别

传统酶连法：

1.“切割”：首先，利用特定的限制性内切酶（如EcoRI、BamHI）在载体DNA和待插入的目的片段两端进行切割。这些酶能识别特定的DNA序列（如GAATTC），并在其上或附近切断DNA链，产生特定的末端（粘性末端或平末端）。

2.“匹配”：理想情况下，载体和目的片段被切割后，其产生的末端必须严格互补（如同匹配的钥匙与锁），这样才能通过碱基配对进行有效粘合。

3.“连接”：最后，在T4 DNA连接酶的作用下，载体和目的片段末端之间形成稳定的磷酸二酯键，完成重组分子的组装。

然而，这一经典方法存在明显局限：

必须找到载体和目的片段上同时存在且兼容的限制酶切位点。繁琐的位点筛选、酶切组合优化，甚至改造片段，过程耗时且繁琐。

酶切后，限制性酶切位点本身的序列会永久性地留在最终的重组DNA分子中，这些额外的序列有时会干扰后续实验（如蛋白表达）。

而且操作步骤多（切割、纯化、连接），耗时长，且连接效率受末端匹配度、酶切效率等多因素影响，尤其对于大片段或复杂克隆成功率较低。

无缝克隆是一种新的、快速、简洁的克隆方法，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体。

无缝克隆：

区别于传统PCR产物克隆，唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基。

引物设计图示

图1. 引物设计图示

依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌，进入宿主菌中的线性质粒（环状）依靠自身酶系将缺口修复。

传统分子克隆和无缝克隆对比

图2. 原理示意图

传统分子克隆和无缝克隆对比：

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