@科研人：抗体选择困难？功能、机制与应用场景全解析来了！

一、抗体的定义和结构

抗体（antibody）是指机体免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产生的一类免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig），能够与相应抗原发生特异性结合反应。早在19世纪80年代，科学家在研究病原菌的过程中就发现了抗体的存在，但直到20世纪60年代，其分子结构才得以明确（见图1）。

图1. 抗体结构

抗体的基本结构呈“Y”型，由两条相同的重链（Heavy chain，H链）和两条相同的轻链（Light chain，L链）通过链间双硫键和非共价键连接而成。

整个抗体分子可分为恒定区（Constant Region，C区）和可变区（Variable region，V区）两部分，C区位于“Y”型结构的底部，决定抗体的类型及其与免疫系统中其他成分协同作用的方式；V区位于“Y”型结构的顶端，负责识别并结合特定抗原，是抗体实现特异性结合的关键区域。

在V区内部，有一小段氨基酸序列变异程度极高，称为高变区（hypervariable region，HVR）或互补决定区（complementarity determining region，CDR）。该区域通常由2~17个氨基酸残基组成，其氨基酸残基的种类、排列和立体构象具有高度多样性，决定了不同抗体在结构上的细微差异，也是特异性结合抗原的关键部位，这一区域又被称为抗原结合片段(antigen-binding fragment，Fab)。非HVR区的部分氨基酸序列相对保守，称为骨架区（framework region，FR）。

每个抗体分子含有两个相同的抗原结合部位，分别位于“Y”型结构的两臂末端，即Fab段。该片段由完整的V区和CH1结构域共同构成，负责识别和结合抗原靶标，决定了抗体的特异性与亲和力。“Y”型结构的柄部为结晶片段（fragment crystallizable，Fc），由CH2和CH3结构域组成，负责与免疫效应分子或细胞相互作用，从而激活下游免疫应答。在CH1和CH2之间有一个铰链区，连接抗体的Fab段和Fc段，该区域赋予Fab段一定的灵活性与移动能力，使抗体能够适应不同距离的抗原表位，从而更有效地执行功能。

二、抗体检测原理

了解了抗体的结构后，其作用原理就更容易理解。抗体通过与抗原发生特异性结合来反映抗原的性质和含量。抗原表面存在抗原决定簇（表位），可被抗体特异性识别并结合。抗体与抗原决定簇之间的结合强度用“亲和力”来表示。抗体的可变区（V区）通过氢键、范德华力等弱非共价作用与抗原表位结合，相互作用越强，则亲和力越高，抗体的特异性也越强。在实际应用抗体之前，通常需要对其滴度、交叉反应性、特异性及亲和力等性能进行系统鉴定。

图2. 抗原抗体结合原理示意图

（1）抗体滴度

抗体滴度（亦称效价）的测定通常采用倍比稀释法：将含抗体的血清、细胞上清或腹水等样本进行稀释，分别加入定量的标记抗原（Ag），经孵育后分离结合的抗原-抗体复合物（Ag*Ab，即B）与未结合的标记抗原（即游离，F）。通过检测相应信号，当结合部分与游离部分之比（B/F）等于 1，即结合部分占总抗原量（T）的 50%（B/T = 50%）时，所对应样本稀释倍数的倒数即为该抗体的滴度。

（2）交叉反应

若某抗体仅与免疫原（iAg）的某一表位结合，称为无交叉反应抗体；若能与其他抗原（含一个或多个结构相同或相似表位）结合，则称为有交叉反应的抗体。这类可发生交叉反应的抗原称为交叉反应原（cross reacting antigen，cAg）。

交叉反应的程度常用交叉反应率（C%）表示，计算公式如下：

交叉反应率（C%）= ED₅₀(cAg) / ED₅₀(iAg) × 100%

其中，ED₅₀(cAg) 指交叉反应原达到50%结合时的浓度，ED₅₀(iAg) 指免疫原达到50%结合时的浓度。

（3）特异性

抗体的特异性是指抗体结合抗原时的专一程度。若某抗体仅识别抗原的某一个表位，并能够区分不同抗原之间一级结构、同分异构体或空间构象的差异，则称为高度特异性抗体。特异性的高低可通过交叉反应率（C%）判断：C% 值越小，表明抗体的特异性越高。

（4）亲和力

抗体的亲和力指一个单价抗体单位（如 Fab 段）与一个抗原表位相结合的速度、强度及稳定性。亲和力大小通常以亲和常数（KD）表示。最常用的计算方法是标准作图法：以 B/F 为纵坐标、B 为横坐标绘制曲线，所得直线斜率的负数即为 KD 值。

三、抗体分类

根据重链恒定区的结构差异，可将其分为IgM、IgG、IgA、IgE、IgD五类。其中IgG结构稳定，持续时间长，易于获得，是研究应用的首选抗体。

图3 IgM、IgG、IgA、IgE、IgD结构示意图

除了根据结构差异进行分类外，研究人员还常依据抗体的功能、靶标类型等对抗体进行进一步划分。

1、根据抗体功能差异，抗体可分为单克隆抗体、多克隆抗体和重组抗体。

2、根据靶标类型分为目的基因特异性抗体和标签特异性抗体。

基因特异性抗体直接检测目的蛋白，操作方便，但仅可检测特定蛋白，不能通用，成本相对较高，无法区分内源性和外源性蛋白。标签特异性抗体通用性强，灵敏度高，可区分内源性和外源性蛋白，荧光蛋白标签还可实现目的蛋白的示踪，且成本相对较低。

3、根据结合的目标分子可分为一抗和二抗。一抗直接与目标抗原结合；二抗则识别一抗的恒定区，常用于信号放大和检测。

在抗体制备过程中，常采用抗体标记技术，将易检测且高灵敏度的示踪物质（如酶、荧光染料等）共价连接到抗体上，通过标记物的信号放大作用，实现对反应体系中抗原性质与含量的定性和定量分析。

若抗原特异性结合的一抗自身携带标记物，则可采用直接检测法。但由于标记一抗制备成本较高，研究人员更常使用间接检测法：即先使用未标记的一抗与抗原结合，再利用带有标记的二抗与一抗结合，通过检测二抗上的标记信号间接反映抗原的表达情况。常见的酶标记物如辣根过氧化物酶（HRP），以及荧光染料如FITC、PE、APC和PerCP等，均广泛用于抗体标记。

一抗与二抗的物种匹配选择尤为关键，通常遵循“二抗看一抗，样本避一抗”的原则。即一抗的宿主物种应不同于样本物种，以避免内源性免疫球蛋白的干扰；而二抗则须针对一抗的物种来源进行选择，确保其能够特异性地识别并结合一抗。

图4 抗体作用原理示意图

四、抗体应用

抗体是分子生物学研究中不可或缺的工具，广泛应用于对目标蛋白的检测、定性与定量分析。以下列举了几类常见的抗体应用场景：

表1 抗体应用

注：WB、IF、Co-IP、ChIP汉恒生物公众号均发表过实验指南，可点击对应实验名称前往查看。

汉恒生物现已推出抗FLAG小鼠单克隆抗体（M2表位）和HRP偶联抗FLAG小鼠单克隆抗体（M2表位）两款抗体产品，抗体针对DDDDK标签（M2表位），结合FLAG标签序列，灵敏度高，特异性强，用于定位和表征FLAG标记蛋白，适用于WB和Fc实验。正在做WB或者Fc实验的小伙伴可以申请试用装哦~

图5. WB实验结果图

图6. Fc实验结果图

五、抗体选择的关键考虑因素

不同实验类型对抗体的性能要求各不相同。例如，Western Blot（WB）通常需要高特异性的抗体以最大限度减少交叉反应；免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）则要求抗体能够识别处于天然构象的抗原；而对于固定和透化处理后的样本，需选用经验证适用于此类处理的抗体。因此，在选择抗体时，除明确其推荐应用范围外，还需综合考虑以下因素：

1、宿主物种的匹配性：

所选抗体的宿主物种应与实验样本的物种不同，以避免二抗与样本内源免疫球蛋白发生交叉反应，从而影响结果特异性。

2、单克隆与多克隆抗体的选择：

单克隆抗体：特异性高、批间一致性好，适用于定量实验（如ELISA、流式细胞术）；

多克隆抗体：通常亲和力较高、灵敏度好，更适合检测低丰度蛋白或结构修饰性抗原。

以上就是本期的全部内容，从抗体的定义和结构出发，详细介绍了抗体的功能、分类和应用，下期将详细介绍抗体在流式细胞术中的应用，感兴趣的同学可以关注一下哦~