IF=20.3 | 让烧伤创面“闭嘴”，新型缓释水凝胶让miRNA疗法不再昙花一现

烧伤创面愈合是临床面临的重大挑战，全球每年约18万人因此死亡，且治疗费用高昂。与普通创面相比，烧伤创面微环境更为复杂，其特征性的氧化应激状态会损害线粒体功能、抑制角质形成细胞迁移并引发持续的炎症反应，严重阻碍了上皮化进程。尽管生长因子疗法和生物敷料等现有治疗手段已取得了一定的成效，但普遍存在药物突释、滞留性差、易降解等问题，加之氧化应激微环境对表皮细胞功能的抑制作用，临床疗效受到了显著限制。近年来，miRNA在氧化应激相关疾病中展现出治疗潜力，但针对烧伤创面的研究仍属空白，且游离miRNA易被核酸酶降解的特性制约了其在临床的应用。虽然外泌体可作为miRNA递送载体，但其存在创面滞留时间不足的局限；而新兴的MXene纳米材料兼具抗氧化、抗炎和增强复合材料的机械性能等特点，为水凝胶敷料的改进提供了新思路。因此，鉴定调控上皮化的关键miRNA，并开发基于MXene复合水凝胶的靶向递药系统，对突破当前烧伤治疗瓶颈具有重要的科学意义。

2025年6月11日，海军军医大学夏照帆院士团队在《Bioactive Materials》（IF=20.3）上发表题为“AntagomiR-192-5p-engineered exosomes encapsulated in MXene-modified GelMA hydrogel facilitated epithelization of burn wounds by targeting OLFM4”的研究论文。本研究通过高通量测序筛选发现miR-192-5p在氧化应激的人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）模型和烧伤创面组织中显著上调，并证实其通过抑制OLFM4的表达而损害HaCaT细胞的增殖、迁移能力并促进细胞凋亡。接着，研究团队成功构建了负载antagomiR-192-5p（ant-192）的工程化外泌体（Exo-ant-192），并进一步将其封装于由GelMA和MXene纳米片组成的复合水凝胶中，开发出多功能敷料Exo-ant-192@M-Gel。该体系不仅实现了ant-192的持续释放和延缓降解，还展现出显著的抗炎特性，有效改善了烧伤创面微环境并加速上皮化进程。该治疗策略通过miR-192-5p/OLFM4轴显著促进表皮细胞功能，为烧伤创面愈合提供了新型靶向治疗方法和药物递送平台。

Exo-ant-192@M-Gel制备流程及促进烧伤愈合示意图

汉恒生物有幸为作者提供了针对OLFM4基因的siRNA，成功敲低了其在HaCaT细胞中的表达，阐明了miR-192-5p在烧伤创面愈合中的作用机制。

下面我们一起来看看作者是如何进行鉴定和开发的：

1. 在HaCaT细胞氧化应激模型及烧伤创面中，miR-192-5p表达水平显著上调

为鉴定HaCaT细胞在氧化应激过程中起关键作用的miRNAs，作者使用0.6 mmol/L H2O2处理12小时以建立HaCaT细胞氧化应激模型，并通过高通量测序进行分析。结果发现，氧化应激细胞模型中有24个差异表达的miRNA，其中miR-192-5p因基线表达水平最高且上调倍数较高（上调2.27倍）被作为候选基因进行后续的验证；同时，qPCR结果证实了这点（图1 A-E）。进一步对组织进行检测发现，在伤后第6天的烧伤创面边缘组织中miR-192-5p的表达量较全层皮肤缺损创面更高（高1.7倍）（图1 F）。综上，提示miR-192-5p可能与氧化应激及烧伤创面愈合缓慢有关。

图1. 功能性miRNA的鉴定与筛选

2. 过表达miR-192-5p会抑制正常伤口愈合，敲低则可促进体内烧伤创面的愈合

作者通过在C57BL/6小鼠中建立全层皮肤缺损和烧伤模型，探究了miR-192-5p对创面愈合的影响。结果显示，在全层皮肤缺损模型中，通过创面边缘注射ago-192来过表达miR-192-5p会显著抑制创面愈合，并延缓上皮再生（图2 A-D）；而在烧伤模型创面边缘注射ant-192来抑制miR-192-5p，则显著促进创面愈合，同时加速上皮再生（图2 E-H）。

图2. 在体内研究miR-192-5p对伤口愈合的影响

3. 过表达miR-192-5p抑制了HaCaT细胞的增殖和迁移，同时促进其凋亡及ROS生成；相反，则可逆转氧化应激诱导的HaCaT细胞功能抑制。

接着，作者通过多种细胞功能实验系统评估了miR-192-5p对HaCaT细胞活性的影响，包括细胞增殖、迁移、凋亡及氧化应激反应。使用miR-192-5p mimic转染HaCaT细胞后，CCK-8实验结果显示细胞活力明显下降，划痕实验证实迁移能力减弱，而Annexin V-FITC/PI染色结合流式检测显示细胞凋亡率升高，DCFH-DA染色表明ROS生成增加（图3）。

图3. miR-192-5p抑制HaCaT细胞增殖与迁移，并促进细胞凋亡及氧化应激

相反，在氧化应激条件下，使用inhibitor抑制miR-192-5p表达能够逆转这些效应（图4）。这些结果表明，miR-192-5p主要通过影响表皮细胞功能参与伤口修复过程。

图4. 氧化应激条件下，敲低miR-192-5p对HaCaT细胞功能的影响

4. miR-192-5p通过靶向OLFM4调控HaCaT细胞功能

为阐明miR-192-5p在HaCaT细胞中的调控机制，作者在HaCaT细胞中过表达miR-192-5p后进行转录组测序分析。结果发现，过表达miR-192-5p可导致HaCaT细胞中286个基因差异表达，并通过与miRWalk数据库预测靶基因进行交集分析，锁定OLFM4作为关键候选基因（图5 A-C）。双荧光素酶报告实验证实miR-192-5p可直接结合OLFM4 mRNA的3’UTR区；此外，qPCR、免疫荧光和WB验证了miR-192-5p过表达会显著降低OLFM4的表达，而抑制miR-192-5p则增加其表达（图5 D-P）。

图5. miR-192-5p下游靶基因的筛选与验证

随后，挽救实验表明，OLFM4过表达可逆转miR-192-5p mimic对HaCaT细胞活力、迁移、凋亡及ROS生成的负面影响（图6）。

图6. 过表达OLFM4保护了HaCaT细胞免受miR-192-5p诱导的功能障碍

相反，在氧化应激条件下，敲低OLFM4会抵消miR-192-5p抑制剂的保护作用（图7）。

图7. 在氧化应激模型中，敲低OLFM4可逆转抑制miR-192-5p后对HaCaT细胞功能的保护作用

进一步的转录组分析和KEGG通路富集显示，OLFM4通过调控“细胞生长与死亡”相关通路来影响HaCaT细胞功能，包括上调BCL2、E2F2、CCNE1/2等基因的表达（图8）。这些结果为阐明OLFM4调控HaCaT细胞功能的机制提供了新的实验依据。

图8. 探究OLFM4影响HaCaT细胞增殖与凋亡的机制

5. antagomiR-192-5p工程化外泌体的制备与表征

接着，作者成功开发并表征了携带ant-192的工程化外泌体。通过透射电镜（TEM）观察到其具有典型的外泌体形态特征，纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测显示其粒径分布符合天然外泌体特性，WB检测证实其表达外泌体标志蛋白CD81、HSP70和TSG101，而不表达阴性标志物Calnexin（图9 A-C）。荧光标记实验证明，这些工程化外泌体能够有效被HaCaT细胞内化，并将ant-192释放至细胞核周区域，载药效率达到35.22±0.34%（图9 D, E）。功能实验表明，与对照组ant-NC相比，负载ant-192的外泌体能够显著降低HaCaT细胞中miR-192-5p的表达水平，并在氧化应激条件下，有效增强细胞活力、促进细胞迁移并减少细胞凋亡，证实了该递送系统的治疗潜力（图9 F-K）。

图9. miR-192-5p工程化外泌体的制备与表征

6. Exo@M-Gel水凝胶的制备与表征

作者还进一步成功制备了负载外泌体的MXene复合水凝胶（Exo@M-Gel），表征结果显示，光固化后的水凝胶具有良好的可注射性，且冻干后的Exo@Gel和Exo@M-Gel均具有疏松多孔的结构（图10 A-C）。CCK-8实验证实两种水凝胶均无细胞毒性，且降解速率相当，而Exo@M-Gel相较于Exo@Gel具有更缓释的外泌体释放特性和更优的压缩应力（图10 D-H）。此外，通过体外抗炎实验表明，Exo@M-Gel能显著降低LPS刺激的RAW264.7细胞中iNOS、IL-1β和TNFα的表达水平（图10 I-K）。

图10. Exo@M-Gel水凝胶的制备与表征

7. Exo-ant-192@M-Gel水凝胶保护表皮细胞功能并加速烧伤创面愈合

最后，作者探究了Exo-ant-192@M-Gel水凝胶在烧伤治疗中的效果，包括缓释性能和促进愈合的能力。通过体内荧光示踪结果显示，Exo-Cy3-ant-192@M-Gel组在第7天仍保持最强荧光信号，显著优于各对照组（图11 A）。表明其具有Cy3-ant-192持续释放的特性。另外，在小鼠烧伤模型中，Exo-ant-192@M-Gel治疗组表现出最优的创面修复效果：伤后第12天即实现约97.49%的创面愈合率，组织学检测显示完全上皮化，Ki67和CK14表达显著增加，提示创面表皮细胞增殖能力和细胞活性显著增强（图11 B-I）。以上结果表明，Exo-ant-192@M-Gel水凝胶系统对于烧伤治疗具有显著疗效，这为烧伤创面修复提供了新型的复合治疗策略。

图11. Exo-ant-192@M-Gel持续释放ant-192并加速烧伤创面愈合

综上所述，本研究揭示了抑制miR-192-5p在烧伤创面愈合中的治疗潜力，通过创面边缘局部注射miR-192-5p抑制剂ant-192可显著加速伤口愈合过程，其作用机制主要是通过上调表皮细胞中的OLFM4表达，进而激活与细胞生长和死亡相关的下游通路，最终维持表皮细胞功能。研究团队还开发了一种具有缓释功能的Exo-ant-192@M-Gel水凝胶载药系统，该系统不仅能延缓ant-192的降解，还展现出抗炎特性。这一创新性给药平台为烧伤创面愈合提供了新的治疗策略。