随着全球肥胖与代谢综合征患病率的不断攀升，代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）已成为最常见的慢性肝病之一。鞘氨醇-1-磷酸（S1P）作为一种生物活性脂质，参与多种生理过程并与多种疾病相关，其合成主要由鞘氨醇激酶（SphK）的两种亚型——SphK1和SphK2催化完成。然而，目前关于SphK2功能的研究仍较为有限，尤其对其在肝脏脂质代谢调控中的潜在作用尚不清楚。
2025年4月8日，安徽医科大学周洪团队在Cell Death & Differentiation（IF=13.7）上发表了题为“Sphingosine kinase 2 deficiency impairs VLDL secretion by inhibiting mTORC2 phosphorylation and activating chaperone-mediated autophagy”的研究论文。研究发现Sphk2-/-小鼠表现出肝细胞脂质积聚和极低密度脂蛋白（VLDL）分泌减少；机制研究表明，SphK2缺陷通过分子伴侣介导的自噬(CMA)，降解了参与囊泡运输的SNARE（可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）复合物组分，阻碍了VLDL转运至高尔基体；mTORC2磷酸化和外源性S1P补充能改善脂质积累和VLDL的分泌。汉恒生物有幸为作者提供了KFERQ-eRFP-N1慢病毒探针用于检测CMA。下面介绍研究的主要成果。
SphK2缺失导致肝细胞中甘油三酯的积聚
为了确定SphKs与肝脏脂质代谢的关系，作者检测了MASLD患者和健康人的肝脏组织中的SphKs表达，发现MASLD患者的SphK2蛋白水平显著低于健康人的；并且MASLD患者肝脏在接近脂质积聚的区域，SphK2蛋白降幅超过60%，而SphK1蛋白水平则无显著差异。高脂肪饮食(HFD)喂养的小鼠和暴露于棕榈酸的Hepa1-6细胞中，SphK2蛋白水平也是显著降低。说明SphK2蛋白水平和肝组织中脂质稳态之间呈负相关。
动物模型研究表明，在随机饮食喂养、禁食、禁食后再喂养或四周HFD喂养的条件下，检测WT小鼠、Sphk1-/-小鼠和Sphk2-/-小鼠肝脏和外周血中的甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）水平，结果显示Sphk2-/-小鼠中的这些指标比Sphk1-/-小鼠表现出更显著的变化。从WT、Sphk1-/-、Sphk2-/-小鼠中提取原代肝细胞，油红O和BODIPY染色显示，Sphk2-/-肝细胞中的脂质含量显著高于Sphk1-/-和WT肝细胞，TG水平也升高，但TC水平没有显著变化。体外实验中，SphK2特异性抑制剂ABC294640可诱导Hepa1-6细胞中出现显著的脂质积聚，而SphK1特异性抑制剂PF-543对Hepa1-6细胞则没有这种作用。总的来说，SphK2在平衡肝脏脂质代谢方面比SphK1有着更重要的作用。
图1 Sphk2−/−小鼠肝脏中TG积聚
Sphk2−/−小鼠肝脏VLDL-TG分泌减少
随后，作者检测了Sphk1−/−和Sphk2−/−小鼠的血浆脂质含量。快速蛋白液相色谱（FPLC）分析显示，Sphk2−/−小鼠VLDL组分中的TG水平显著低于WT和Sphk1−/−小鼠，而低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）组分中的TG水平则没有显著降低。将四丁酚醛（抑制血浆脂解活性）注射到小鼠体内以评估VLDL分泌能力，观察到Sphk2−/−小鼠的肝脏VLDL分泌率显著低于WT和Sphk1−/−小鼠；对Hepa1-6细胞添加ABC294640处理，同样也显著降低了VLDL的分泌。说明SphK2在肝细胞分泌VLDL中起到至关重要的作用。
为进一步确定SphK2是否参与肝脏中的其他TG代谢途径，提取分离Sphk2−/−和WT小鼠的原代肝细胞，进行蛋白质组学分析。鉴定到110种差异表达蛋白，其中ACC1水平降低和LCADα表达增加，表明游离脂肪酸（FFA）合成减少和β-氧化加速，这可能是由于过度的TG积累。以上结果说明SphK2的缺乏导致肝脏VLDL分泌减少，进而引起肝脏脂质积聚。
图2 Sphk2−/−小鼠肝脏VLDL-TG分泌减少
Sphk2−/−小鼠肝细胞中VTV和高尔基体之间的融合受损
Sphk2−/−和WT小鼠原代肝细胞的蛋白质组学分析表示，“囊泡转运中的SNARE相互作用”是最富集的途径；GO分析表明，差异蛋白富集于“细胞器膜融合”、“细胞器融合”和“膜融合”等生物过程中。这些数据说明Sphk2缺失影响肝细胞中的膜融合和识别过程。
已有文献证实，VLDL在内质网腔内合成后，由VLDL转运囊泡(VTV)负责转运到顺式高尔基体，随后分泌到循环系统中；这种转运依赖于SNARE复合物的识别，特别是VTV和高尔基体之间的识别。所以作者用ABC294640处理Hepa1-6细胞，检测发现VTV囊泡组分SEC31、SEC23和SEC24的蛋白水平随时间推移逐渐增加；而SNARE复合物组分SEC22B（锚定于VTV）、STX5A和GS28的蛋白水平显著降低；SEC22B和STX5A之间的相互作用也被显著抑制。并且ABC294640对SphK2活性的抑制导致VTV和高尔基体之间的脂质运输受损，在高尔基体中未观察到脂质。说明SphK2对VTV和高尔基体之间的融合有着关键作用。
图3 Sphk2−/−小鼠肝细胞中VTV和高尔基体融合受损
SphK2以溶酶体依赖性方式调节SNARE稳定性并加速其降解
上述结果中ABC294640处理虽然降低了SEC22B、STX5A和GS28的蛋白水平，但是没有影响它们的转录水平。所以作者进一步检测了SNARE复合物组分的稳定性，发现SEC22B、STX5A和GS28的半衰期在ABC294640处理后显著缩短。在参与蛋白质降解主要途径的特异性抑制剂中，NH4Cl（一种特异性溶酶体功能抑制剂）处理显著逆转了由ABC294640诱导的STX5A、GS28和SEC22B水平降低和细胞内脂质与TG的积聚。这些结果说明抑制SphK2会加速溶酶体依赖性的SNARE复合物的降解和细胞内脂质的积聚。
图4 SphK2通过溶酶体相关途径调节SNARE稳定性并加速其降解
敲低LAMP2A或HSC70逆转Sphk2缺陷引起的脂质积累
蛋白质组学分析表明，Sphk2-/-小鼠肝细胞中与溶酶体功能相关的通路显著上调。在Sphk2-/-小鼠的肝脏中观察到LAMP2A水平升高，表明CMA发生激活。在Hepa1-6细胞中表达CMA探针KFERQ-eRFP-N1，用ABC294640处理细胞后，细胞内红色荧光斑点的数量显著增加，表明CMA活性增强。此外，在ABC294640处理的Hepa1-6细胞中，敲低LAMP2A或HSC70能显著降低脂质和TG积累并部分恢复VLDL的分泌，同时减轻了ABC294640诱导的SNARE组分蛋白降解，而抑制ATG5（大自噬相关分子）没有表现出类似的恢复效果。这些结果表明，Sphk2缺陷诱导的脂质积累是依赖CMA完成的。
图5 LAMP2A敲低减轻Sphk2缺陷诱导的TG积累
mTORC2激活逆转Sphk2缺陷引起的肝细胞脂质蓄积
随后，作者对Sphk2缺陷的肝细胞中CMA通路的激活机制进行了深入探讨。鉴于mTORC2磷酸化对CMA活性具有负向调控作用，作者在经ABC294640处理的Hepa1-6细胞中添加mTOR激活剂MHY1485，发现MHY1485可显著缓解脂质积聚现象。为进一步明确mTOR的作用机制，作者通过siRNA分别沉默mTORC1亚基Raptor和mTORC2亚基Rictor进行功能验证。结果显示，在Raptor沉默时，MHY1485仍能有效恢复ABC294640导致的SNARE复合物蛋白（SEC22B、STX5A与GS28）降解，并逆转其诱导的细胞内脂质及TG积聚；而在Rictor被沉默后，MHY1485则不具有相似的挽救效应。此外，ABC294640处理抑制了mTORC2下游靶标（AKT、GSK3β、PKCα、SGK1）的磷酸化水平。这一系列实验表明，SphK2活性抑制会特异性阻断mTORC2信号通路，进而通过增强CMA途径导致SNARE复合物蛋白降解，最终促进肝细胞中TG的积累。
图6 mTORC2磷酸化的增加逆转了Sphk2缺陷引起的VLDL分泌减少
S1P上调mTORC2磷酸化以维持细胞内脂质稳态
S1P由SphKs催化生成，可以激活mTOR途径。在Sphk2⁻/⁻小鼠肝脏中观察到S1P含量显著降低；同样，在体外实验中，ABC294640处理也可诱导Hepa1-6细胞内S1P呈时间依赖性下降。外源性补充S1P能够显著逆转ABC294640所引起的脂质蓄积，促进TG分泌，从而降低细胞内TG水平。通过siRNA敲低Rictor可阻断S1P的上述作用。此外，外源性S1P可显著增强mTORC2下游信号分子AKT、GSK3β、PKCα和SGK1的磷酸化水平。综上，这些结果说明，抑制SphK2会减少肝脏中S1P的生成，进而下调mTORC2通路活性，最终通过促进SNARE复合物组分SEC22B、GS28和STX5A的降解，抑制VTV与高尔基体融合，损害肝细胞VLDL的分泌能力。
图7 S1P上调mTORC2磷酸化以维持细胞内脂质稳态
本研究创新性地阐明了一种调控肝脏脂质代谢的新机制：SphK2可通过激活mTORC2磷酸化来抑制CMA，进而促进VLDL分泌、维持肝脏脂质稳态。这一发现不仅揭示了SphK2功能及其调控VLDL分泌的潜在机制，也为靶向SphK2-S1P-mTORC2-CMA通路治疗肝脏脂质代谢性疾病提供了重要理论依据。
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