在上一期内容中，小恒为大家系统介绍了肺类器官的相关知识。本期我们将聚焦于肝脏类器官，从来源、培养构建方法、病毒感染技术及其应用等方面对肝脏类器官相关研究进展与技术应用进行详细阐述。
肝病的发病率正逐年上升，全球每年因肝病导致的死亡人数约达200万[1]。肝脏作为人体最大的实质性器官，在代谢、解毒、蛋白质合成等多种复杂生理过程中扮演关键角色。然而，肝脏也容易受到多种损伤因素的影响，常见原因包括病毒感染、酒精、药物、癌症、自身免疫性疾病及代谢紊乱等，这些均可导致肝损伤及功能障碍。目前，肝损伤研究主要依赖于二维（2D）细胞系培养和动物模型，但由于各类肝损伤的致病机制复杂，传统模型难以充分模拟其损伤过程，且动物实验的结果往往不能直接推广至人体。
近几十年来，类器官技术取得了重要进展。“类器官”是指由干细胞或祖细胞在体外培养形成的三维（3D）结构，具备自我组织能力，能够重现体内组织的结构及特定功能。类器官不仅具有原代组织的空间结构与微环境，还能保持稳定的遗传背景，展现出独特的应用优势。自2009年首个由肠道Lgr5+干细胞诱导产生的类器官成功构建以来[2]，该技术不断发展；至2013年，肝脏类器官也相继建立[3, 4]，并逐步应用于生物医学的多个研究领域。
不同来源的肝脏类器官发展历程
肝脏位于人体右上腹部，其基本功能单位是肝小叶。每个肝小叶由中央静脉（CV）、门管三联体以及从中央静脉向门管三联体呈放射状排列的肝细胞索构成（图1）。门管三联体包含肝动脉、门静脉和胆管。此外，肝腺泡也被视为肝脏的功能单位，依据其与动脉血供的距离可划分为三个不同区域[5]。
肝脏兼具内分泌与外分泌功能，具体涵盖胆汁生成、血浆蛋白分泌、大分子物质储存、代谢物合成、激素产生以及药物代谢等。这些复杂功能的实现，依赖于肝细胞、胆管细胞以及包括星状细胞、库普弗细胞和肝血窦内皮细胞在内的非实质细胞的协同作用[6]。
肝脏类器官的构建（图2），为在体外重现这一高度复杂的结构与功能提供了理想模型，有助于进一步深化我们对人类肝脏生物学及其相关病理机制的理解。
图1. 肝脏的基本结构
1.1 组织来源的肝脏类器官
原代肝细胞是构建肝脏类器官的主要细胞来源之一。2013年，Huch等人借鉴肠道类器官的培养体系，首次成功建立了胆管细胞类器官。该研究证实，无论是来自受损还是健康的小鼠肝脏组织，其分离出的Lgr5⁺细胞均能在含有R-spondin 1的培养基中进行克隆性扩增，形成可长期（数月）稳定培养的类器官结构[3]。两年后，研究人员通过微调小鼠类器官的培养条件，进一步建立了首个人类胆管细胞三维培养体系。其中，添加小分子抑制剂A83-01能够特异性抑制TGF-β受体Alk4/5/7，从而显著延长培养时间并提高集落形成效率；而补充毛喉素（Forskolin）则可上调Lgr5及胆管标志物CK19的表达[7]。2018年，Hu等人在上述胆管细胞培养体系的基础上，引入了促进肝细胞定向分化的细胞因子，成功建立了一套新方案，使小鼠和人类的肝细胞也能以类似的三维方式实现扩增[8]。同年，Peng等人的研究发现，肿瘤坏死因子α（TNFα）可能在肝细胞类器官的扩增中发挥关键作用。他们将分离的小鼠肝细胞包埋于低生长因子基质胶中，在含有表皮生长因子（EGF）、肝细胞生长因子（HGF）和TNFα的培养基中培养，两周后即可形成类器官，该结构特征稳定并可连续传代培养超过6个月[9]。近期，Liu等人报道了一种新型优化条件，通过精确调控三碘甲状腺氨酸（T3）浓度并减少部分生长因子的使用，成功构建出具有更成熟代谢功能的小鼠和人类肝细胞类器官[10]。
1.2 多能干细胞来源的肝脏类器官
多能干细胞（PSCs）因其具有无限增殖潜能，并能分化为内、中、外三个胚层的所有细胞类型，成为构建功能完备的肝脏类器官的理想种子细胞。2013年，Takebe等人开创性地将诱导多能干细胞（iPSC）分化的内胚层细胞（iPSC-HE）与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）及人间充质干细胞（MSCs）进行三维共培养，成功获得了可自组装形成的iPSC来源肝芽（iPSC-LB）。该结构在移植至非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠体内后，不仅能成功定植，还可与宿主血管系统建立有效连接[4]。2017年，Asai等人的研究进一步揭示了旁分泌信号在类器官成熟过程中的重要作用。他们发现，iPSC-HE与HUVECs或MSCs的共培养体系中，三种细胞间的直接接触是三维结构形成的关键；即使在Transwell非接触共培养条件下，旁分泌的可溶性因子仍能有效诱导iPSC向肝细胞分化。蛋白质组学分析鉴定出血管紧张素、α-2巨球蛋白和纤溶酶原等是触发这一分化的关键旁分泌因子[11]。同年，Guan等人在模拟人类肝脏发育与构建类器官方面取得重要突破。他们开发了一套通过逐步调整生长因子与小分子化合物，精确引导iPSCs经历与体内肝脏胚胎发育相似阶段的分化方案，成功生成了由肝细胞和胆管细胞组成的人类肝脏类器官。这些类器官中的胆管细胞能有序排列成胆管样结构，并展现出人类特有的再生能力，即单个原代类器官可进一步产生次级类器官[12]。
图2. 不同来源的肝脏类器官培养
肝脏类器官的构建方法
以诱导多能干细胞（iPSC）来源的肝脏类器官为例，其构建流程如图3所示 [12]。
2.1 初级肝脏类器官的制备
初级肝脏类器官（HO1s）的培养始于iPSCs的单细胞解离。首先，将iPSCs使用含5 mM EDTA和10 μM Y-27632的缓冲液处理为单细胞悬液，随后以每皿1×10⁵个细胞的密度接种于低黏附性60 mm培养皿中。
1.第0至3天（内胚层诱导）：使用内胚层诱导培养基进行培养。该培养基以DMEM/F12为基础，添加1× ITS、0.1 mM非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠、100 ng/mL激活素A、10 ng/mL BMP4以及10 μM Y-27632。
2.第3至9天（前肠球体形成）：更换为含B27补充剂及2%（v/v）生长因子减少型基质胶的RPMI培养基。其中，第3至6天添加50 ng/mL FGF10；第6至9天则添加10 ng/mL FGF10与10 ng/mL BMP4。
3.第9天后（肝向分化）：转换为类器官生长分化培养基，其组成为：补充1%基质胶、50 ng/mL HGF、50 ng/mL制瘤素M以及10 μM地塞米松的基础培养基。
培养至第20天，收集形成的类器官，以备后续传代、进一步分化与鉴定。
2.2 次级肝脏类器官的制备
为获得次级肝脏类器官（HO2s），取培养第20至50天的HO1s进行消化。
1.消化与重悬：先后使用1 mg/mL胶原酶（消化30分钟）和0.25%胰蛋白酶-EDTA（消化10分钟）处理。消化结束后，以200×g离心3分钟收集细胞，并将其重悬于50 μL生长因子减少型基质胶中。
2.接种与扩增：将细胞悬液以每孔1000个细胞的密度接种于24孔板。待基质胶凝固后，每孔加入1 mL生长培养基，培养6天。生长培养基为添加了B27的RPMI，并包含以下因子：250 nM LDN-193189（BMP抑制剂）、3 μM CHIR99021（WNT激活剂）、10 μM A83-01（TGF-β抑制剂）、100 ng/mL EGF、10 ng/mL FGF10及20 ng/mL HGF。
3.终末分化：随后，将培养基更换为分化培养基，继续培养6天。分化培养基以肝细胞培养基（HCM）为基础，补充10 μM DAPT（Notch抑制剂）、10 ng/mL制瘤素M、20 ng/mL HGF、10 μM地塞米松以及10 ng/mL BMP4。
图3. 肝脏类器官的构建
肝脏类器官的病毒感染方法
慢病毒（LV）、腺病毒（AD）与腺相关病毒（AAV）是常用于基因表达调控的三大病毒载体，其各自特点已在类器官系列前期内容中介绍。以下将详细介绍使用慢病毒感染人肝脏类器官的具体操作流程[13]。
1.类器官收集与解离：收集早期传代（第0–3代）的人肝脏类器官，置于预冷的 Ad+++* 溶液中，冰上孵育10分钟以溶解并去除包裹的基底膜基质胶（BME）。随后，以200 × g 离心5分钟，收集沉淀。
2.单细胞制备：将上述沉淀重悬于 TrypLE Express 消化酶中，孵育至消化为单细胞悬液（单个细胞比例 > 80%）。再次以200 × g 离心5分钟，收集细胞。
3.病毒感染：将细胞重悬于1 mL 含有慢病毒颗粒的培养基中，并平均分装至48孔板的4个孔内。将培养板以600 × g 离心1小时（离心感染），随后转移至37°C培养箱中静置孵育5小时。
4.接种与培养：感染结束后，以200 × g 离心5分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于适量的BME中，并接种于培养板内。待BME凝固后，每孔加入含25 ng/mL Noggin 和10 µM Y-27632 的扩张培养基（EM）。
5.筛选与恢复：感染4天后，将培养基更换为含有25 ng/mL Noggin、10 µM Y-27632 以及5 µg/mL 杀稻瘟菌素（Blasticidin，对应慢病毒携带的BSD抗性基因）的筛选用EM。在此条件下培养7天后，更换回不含杀稻瘟菌素的常规EM。待类器官恢复生长后，可进行常规传代以去除残留的死细胞，并随后按标准方案继续培养（流程见图4）。
*注：Ad+++* 溶液为 Advanced DMEM（Gibco），补充有1% 磷脂酰丝氨酸（PS）、10 mM HEPES（Gibco）及1% GlutaMax（Gibco）。
图4. 慢病毒感染肝脏类器官
肝脏类器官的应用
肝脏类器官作为一种前沿的体外模型，因其具备接近生理状态的三维结构、可重现关键的肝脏功能与病理过程、保留供体的遗传背景，并能从少量组织中获得且便于长期冻存与基因操作，已成为疾病建模、再生医学和药物研发等领域的重要工具。
1.在肝脏疾病建模中的应用
类器官技术为研究各类肝病，特别是遗传性疾病，提供了高度模拟的病理模型。
单基因遗传病：
阿拉杰里综合征（ALGS）：主要由 JAG1 基因突变引起。Guan等人利用CRISPR/Cas9技术在健康人iPSCs中引入致病突变（C829X），成功构建了ALGS类器官模型。该模型显示出胆管细胞发育受损、胆管结构异常且丧失再生次级类器官的能力，精准模拟了疾病表型[12, 14]。
α-1抗胰蛋白酶缺乏症（α1-AT）：由 SERPINA1 基因突变导致。从患者活检组织建立的肝脏类器官中，可观察到典型的细胞内蛋白聚集现象，并证实了α-1抗胰蛋白酶分泌显著减少，为研究该病的肝内病理机制提供了平台[7]。
复杂肝病：
肝脏肿瘤：已成功从肝细胞癌、胆管细胞癌及混合型肝癌患者的组织中建立肿瘤类器官。这些模型在长期培养中能稳定保持原发肿瘤的遗传特征，并在移植后重现转移潜能，可用于肿瘤生物学研究和药物测试[15]。
代谢性与毒性肝损伤：利用人iPSCs构建的三谱系类器官模型，成功在体外重现了脂肪变性和脂肪性肝炎的特征[16]。此外，将人胚胎干细胞来源的类器官与间充质细胞共培养，经乙醇处理后能模拟酒精性肝病的脂肪变性、氧化应激、纤维化及炎症等关键病理过程[17]。
病毒性肝炎：iPSC来源的肝脏类器官已成功用于乙型肝炎（HBV）和丙型肝炎（HCV）的感染研究，能够支持病毒复制并模拟细胞间传播过程，为抗病毒药物研发提供了新的模型[18, 19]。
2.在再生医学中的潜力
肝移植是目前终末期肝病唯一的根治手段，但供体严重短缺。肝脏类器官为肝细胞移植和功能替代带来了新希望。
研究表明，将小鼠胆管来源的肝脏类器官移植至肝衰竭模型小鼠体内，虽定植效率较低（约1%），但能显著提高存活率[3]。人胆管来源的类器官移植至免疫缺陷鼠后，能在小鼠血清中长期（超过60天）检测到人源白蛋白和α-1抗胰蛋白酶，证明其具有体内功能[7]。近年来，移植效率也得到了显著的改善。例如，移植小鼠原代肝细胞来源的类器官至 Fah⁻/⁻ 小鼠模型，成功率可达80%[9]；在免疫缺陷肝损伤小鼠中移植人肝细胞类器官后，小鼠血液中人白蛋白浓度可稳定维持在约10 μg/mL[8]。这些进展凸显了类器官在未来临床转化中的应用潜力。
3.在药物研发中的应用
肝脏类器官在疾病建模中的成功，推动了其在药物筛选和个体化医疗中的应用。
药物肝毒性评价：Shinozawa等人开发了基于人类肝脏类器官的384孔板高通量毒性筛选平台，通过测量胆汁酸转运活性等指标，对238种已上市药物进行了系统的肝毒性评估，证明了其在此领域的实用价值[20]。
抗肿瘤药物筛选与发现：肿瘤类器官已成为抗癌药物筛选的有力工具。例如，利用胆管细胞癌类器官进行筛选，发现ERK抑制剂SCH772984具有显著的治疗潜力[15, 21]。此外，来自不同患者的肝细胞癌类器官对索拉非尼等药物表现出异质性反应，这有助于理解耐药机制[22]。
个性化医疗：对27个患者来源的癌症类器官进行大规模（129种药物）药物敏感性测试，发现部分药物具有广谱效应，同时也能鉴定出对特定患者类器官敏感的药物，为制定个体化治疗方案提供了实验依据[23]。这表明肝脏类器官在实现“精准医疗”方面具有重要价值。
图5. 肝脏类器官的应用
综上所述，肝脏类器官作为一种能够高度模拟肝脏结构与功能的体外模型，在疾病机制研究、药物筛选和再生医学等领域展现出巨大潜力。本文系统梳理了其发展历程、主要构建方法及前沿应用，以期为相关研究者提供参考。随着技术的不断进步与完善，肝脏类器官有望在未来生物医学研究和临床转化中发挥更为关键的作用。下期我们将对脑类器官的相关内容进行分享，欢迎大家关注~！
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