CELL丨助力上海交通大学附属第一人民医院王宏林团队揭示谷氨酸能神经调控皮肤衰老的创新机制

IF=64.5 | 汉恒助力上海交通大学医学院附属第一人民医院王宏林团队揭示谷氨酸能神经调控皮肤衰老的创新机制

皮肤衰老是机体衰老的重要外在表现，主要表现为真皮成纤维细胞衰老、胶原蛋白合成减少及细胞外基质稳态失衡。皮肤成纤维细胞是胶原蛋白的主要生产者，其衰老会导致胶原萎缩、皮肤变薄、弹性下降及伤口愈合障碍。尽管已知皮肤内存在丰富的感觉神经纤维，且神经递质在皮肤炎症和稳态调控中发挥重要作用，但外周神经是否直接参与调控皮肤成纤维细胞衰老和胶原代谢，以及其分子机制尚不清楚。特别是，皮肤中哪些神经元亚型介导了神经-成纤维细胞之间的相互作用，以及年龄相关的神经退行性改变是否直接驱动皮肤衰老，均有待阐明。

2026年7月17日，上海交通大学医学院附属第一人民医院王宏林教授团队在《Cell》（IF=64.5）在线发表题为“Skin-innervating glutamatergic neurons modulate aging”的研究论文。揭示皮肤神经通过Nefh–Cdk5–Vglut2–谷氨酸–Slc1a3轴调控成纤维细胞衰老与胶原稳态，为皮肤衰老及纤维化提供了新的机制解释和潜在治疗靶点。

值得注意的是，本研究利用汉恒生物提供的Ad-mouse-sh-Hecw1腺病毒和AAV-mouse-shRNA-Hecw1腺相关病毒，在小鼠DRG神经元和体内皮肤中实现了Hecw1的敲低，证实了Hecw1通过泛素化降解Nefh，从而驱动衰老过程中Nefh的下调。同时，借助Ad-mouse-Cdk5-EGFP过表达腺病毒，在Nefh缺失的DRG神经元中回补Cdk5，验证了Nefh→Cdk5→Vglut2这一因果通路，明确了Cdk5介导Nefh对谷氨酸释放的调控作用。

作者为了探究神经支配是否参与调控衰老进程，首先进行了皮肤手术去神经，后发现组织学染色显示胶原显著减少，且Smad2/3信号通路受抑，表明胶原合成受阻。其次，在Nav1.8-DTR小鼠中通过白喉毒素特异性消融Nav1.8⁺感觉神经元，同样观察到胶原丢失、Smad2磷酸化下降及衰老标志物p16上调。最后，利用树脂毒素（RTX）消融伤害性神经纤维，也获得了真皮胶原减少的一致结果。综上，三种模型的交叉验证共同证明：皮肤去神经可加速胶原丢失与皮肤衰老，确立了神经支配在维持皮肤年轻态中的关键作用，并为后续探索特定神经元亚型及分子机制奠定了基础。

图1 皮肤去神经支配加速皮肤衰老和胶原蛋白丢失

为了鉴定与衰老相关的皮肤支配性神经元，作者分析了老年人皮肤的整体转录组测序数据（GEO: GSE85358）。神经丝重链（NEFH）被鉴定为老年人皮肤中下调最为显著的基因之一。事实上，在老年人及老年小鼠皮肤中，Nefh的蛋白水平均有所下降。为探究NEFH与皮肤衰老之间的关联，作者从一个皮肤衰老相关队列中招募了共计148名受试者，涵盖17至82岁四个年龄组，并对其皮肤进行了免疫荧光染色分析。NEFH表达水平与年龄呈负相关，与皮肤中胶原蛋白I丰度呈正相关。同样，在半乳糖诱导的皮肤衰老小鼠模型中，也观察到Nefh和胶原密度的下调。因此，衰老皮肤中NEFH降低伴随胶原蛋白丢失。

图2 衰老皮肤中NEFH降低伴随胶原蛋白丢失

NEFH是神经元损伤和肌萎缩侧索硬化（ALS）易感性的生物标志物，并定义了含有神经丝的感觉神经元。作者通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）对人皮肤和骨髓进行分析，几乎检测不到NEFH的表达。与此同时，作者注意到，在皮肤手术去神经、DT介导的皮肤去神经以及RTX处理后，Nefh均出现下调，表明Nefh主要表达于皮肤支配性神经元，而非皮肤中的其他细胞类型。小鼠DRG神经元的单核RNA测序显示，Nefh在DRG神经元中可被检测到，而Vglut2（谷氨酸能神经元的经典标志物）在大多数Nefh⁺ DRG神经元中均有表达。值得注意的是，在大多数皮肤支配性神经元中，Vglut2与Nefh共表达，且在Nefh⁺皮肤支配性神经元中，Vglut2的表达水平高于其他谷氨酸转运体（Vglut1、Vglut3、Eaat1、Eaat2、Eaat3、Eaat4和Eaat5）。此外，作者利用Vglut2Cre-tdTomato小鼠标记Vglut2⁺神经，确实在小鼠皮肤和DRG中观察到了Nefh与Vglut2的共表达。因此，得出结论：Nefh主要表达于Vglut2⁺皮肤支配性谷氨酸能神经元。

图3 Nefh主要表达于Vglut2⁺皮肤支配性谷氨酸能神经元

皮肤成纤维细胞通过产生胶原蛋白来维持真皮的结构。由于衰老皮肤中NEFH的减少伴随胶原蛋白的丢失，作者质疑Nefh⁺皮肤支配性神经元是否位于皮肤成纤维细胞附近，并因此调控胶原蛋白的产生。利用PdgfraDreER-tdTomato小鼠标记皮肤中的成纤维细胞谱系细胞（Pdgfra是真皮成纤维细胞的可靠标志物），通过皮肤整体包埋成像发现，Pdgfra⁺成纤维细胞与Nefh⁺皮肤支配性神经元相接触。同样，通过使用Col1a2CreER-tdTomato小鼠标记皮肤成纤维细胞，作者观察到了Col1a2⁺成纤维细胞与Nefh⁺皮肤神经之间的空间相互作用。这些结果表明，皮肤成纤维细胞很可能受到Nefh介导的神经调控。

图4 成纤维细胞与Nefh⁺皮肤神经相接触

为探究衰老皮肤中Nefh下降的机制，作者通过质谱分析鉴定出E3泛素连接酶Hecw1为Nefh的互作蛋白。腺病毒敲低DRG神经元中Hecw1可上调Nefh并减弱其泛素化，提示Hecw1通过泛素化途径促进Nefh降解。在衰老小鼠皮肤和DRG中，Hecw1表达均升高，与Nefh下降趋势相反。为验证其在皮肤衰老中的因果作用，作者将AAV-shHecw1皮内注射至15月龄小鼠，发现敲低Hecw1可显著增加衰老皮肤中Nefh和胶原蛋白含量。综上，Hecw1是导致皮肤衰老过程中Nefh下降的关键上游分子。

图5 Hecw1是皮肤衰老过程中Nefh下降的原因

为探究Nefh对成纤维细胞的作用，作者首先将敲低Nefh的DRG神经与NIH-3T3共培养，发现NIH-3T3中COL1A1、Smad2/3-P表达下降、p16表达升高。随后皮内注射AAV9-hSyn-Cre至Nefhfl/fl小鼠敲除神经元中Nefh，皮肤中同样出现p16表达升高和COL1A1表达下降。最后构建Nefhfl/fl; Vglut2Cre小鼠，在Vglut2⁺谷氨酸能神经元中敲除Nefh，皮肤胶原密度、胶原I和Vglut2均降低。此外，Nefh缺失的DRG神经元培养基还可诱导人成纤维细胞SA-β-gal阳性率升高。以上结果表明，Nefh是谷氨酸能神经元调控皮肤成纤维细胞衰老和胶原合成的关键分子。

图6 Nefh介导谷氨酸能神经对皮肤成纤维细胞衰老和胶原丰度的调控

为探究Nefh缺失对DRG神经元的影响，作者通过AAV2-retro-EGFP逆行标记证实，Nefhfl/fl; Vglut2Cre小鼠皮肤支配性神经元中Nefh⁺神经元显著减少。电生理记录显示Nefh缺失降低DRG神经元动作电位发生频率，提示Nefh对神经元兴奋性至关重要。然而，Nefh缺失不影响神经元活力、轴突密度及泛神经元标志物βIII-tubulin表达，表明其效应并非源于神经退行性变。RNA-seq显示，Nefh敲除小鼠DRG中下调基因富集于ALS疾病通路，且其皮肤胶原丢失表型与ALS患者一致，提示二者共享以胶原丢失为特征的衰老表型。鉴于Vglut2随Nefh缺失而下调，作者通过鞘内注射AAV9-CAG-DIO-EGFP以标记Vglut2⁺突触囊泡，发现Nefh缺失减少Vglut2⁺点状结构数量并减慢其运动速度，提示突触囊泡运输受损。Nefh敲除对GABA、P物质和CGRP的影响各异，表明其调控具有递质选择性。因此，后续研究聚焦于Vglut2相关的主要递质——谷氨酸。

图7 Vglut2+谷氨酸能神经元中的Nefh缺乏加速皮肤老化并降低神经元兴奋性

对Col1a2CreER-tdTomato小鼠皮肤进行整体包埋成像，发现大多数与Nefh⁺皮肤神经相接触的Col1a2⁺成纤维细胞周围均被谷氨酸信号所环绕（与谷氨酸信号的最短距离小于10 μm），提示谷氨酸可能在Nefh介导的皮肤成纤维细胞神经调控中发挥关键作用。事实上，在衰老小鼠皮肤、老年人血浆、老年人皮肤以及小鼠去神经皮肤中，谷氨酸均呈下调趋势，表明谷氨酸丰度与衰老及皮肤神经支配相关。为进一步探究Nefh是否影响DRG神经元中谷氨酸的释放，作者检测了Nefh下调的DRG神经元（经Sh-Nefh慢病毒感染的DRG神经元及Nefhfl/fl; Vglut2Cre小鼠DRG神经元）培养基中的谷氨酸含量。结果显示，DRG神经元中Nefh下调导致谷氨酸含量下降，提示Nefh调控DRG神经元中谷氨酸的释放。

图8 衰老过程中谷氨酸减少，且受Nefh表达的影响

为探究谷氨酸对皮肤成纤维细胞的影响，作者用谷氨酸处理NIH-3T3细胞系、小鼠皮肤成纤维细胞和人皮肤成纤维细胞。结果显示，谷氨酸可促进胶原蛋白生成并降低p16表达，且不影响皮肤成纤维细胞的细胞活力。SA-β-gal染色表明，谷氨酸可减轻人原代真皮成纤维细胞的衰老。为评估谷氨酸在体内的功能，作者对18月龄小鼠皮内注射0、10、100和500 μM谷氨酸。发现100和500 μM谷氨酸均可增强皮肤胶原丰度并降低p16表达，并且低于500 μM的谷氨酸即不影响真皮或表皮中CD45⁺细胞的比例，也不影响角质形成细胞的活力。这表明皮内注射谷氨酸可在不引发皮肤炎症的情况下减轻皮肤衰老。为进一步检测口服补充谷氨酸是否能改善衰老皮肤表型，作者对18月龄小鼠通过灌胃给予0、100和500 μM谷氨酸。同样，口服补充谷氨酸可增强衰老小鼠皮肤的胶原密度并下调p16表达。综上所述，补充谷氨酸可减轻小鼠的衰老皮肤表型。

图9 谷氨酸减轻皮肤成纤维细胞衰老并促进胶原蛋白生成

为深入探究谷氨酸是否对Nefh介导的谷氨酸能神经调控皮肤衰老至关重要，作者对18月龄Nefhfl/fl和Nefhfl/fl; Vglut2Cre小鼠进行皮内注射谷氨酸或不注射处理。结果发现谷氨酸能神经元中Nefh的缺失导致皮肤胶原丢失、谷氨酸下降及p16上调；而皮内注射谷氨酸可增加Nefhfl/fl; Vglut2Cre小鼠皮肤的胶原和谷氨酸丰度，并抑制p16表达。同时，作者分离了18月龄Nefhfl/fl和Nefhfl/fl; Vglut2Cre小鼠的皮肤成纤维细胞，经谷氨酸处理或不处理，发现Nefh缺失增加了衰老成纤维细胞的比例，而补充谷氨酸可减轻细胞衰老。此外，作者用6月龄Nefhfl/fl和Nefhfl/fl; Vglut2Cre小鼠DRG神经元的培养基处理人皮肤成纤维细胞。免疫荧光染色显示，Nefh缺失DRG神经元的培养基降低了人皮肤成纤维细胞中COL1A1的表达，而额外补充谷氨酸可恢复COL1A1的表达。作者对12月龄Nefhfl/fl和Nefhfl/fl; Vglut2Cre小鼠给予或不给予100 μM谷氨酸灌胃，得到了同样结果。因此，谷氨酸对Nefh介导的谷氨酸能神经调控皮肤衰老至关重要。

图10 谷氨酸对Nefh介导的谷氨酸能神经调控皮肤衰老至关重要

为解析Nefh调控谷氨酸释放的分子机制，作者通过质谱分析及GeneMANIA筛选，鉴定出Cdk5为小鼠DRG和皮肤中Nefh的互作蛋白。免疫共沉淀证实Cdk5与Nefh及Vglut2均存在结合，且三者在DRG神经元中可共定位，提示Cdk5可能介导Nefh对谷氨酸的调控。在Nefh敲除的DRG神经元（AAV-Cre处理的Nefhfl/fl及Nefhfl/fl;Vglut2Cre小鼠）中，Cdk5和Vglut2均显著下调，表明Nefh是维持二者表达所必需。而在Nefh缺失的DRG神经元中过表达Cdk5可恢复Vglut2及谷氨酸水平，由此确立了Nefh→Cdk5→Vglut2的因果通路。Cdk5抑制剂处理DRG神经元可下调Cdk5、Vglut2及培养基中谷氨酸含量；该条件培养基处理人皮肤成纤维细胞后，COL1A1表达降低，表明Cdk5对谷氨酸释放及胶原生成至关重要。鉴于胶原在衰老中减少、在纤维化中过度累积，而Cdk5抑制剂可抑制胶原生成，作者进一步评估了其抗纤维化潜力。在博来霉素诱导的皮肤纤维化模型中，Cdk5抑制剂显著抑制真皮纤维化和胶原累积；Nefh缺失同样可缓解纤维化表型。综上，Nefh-Cdk5轴是调控谷氨酸释放与胶原稳态的核心通路，靶向该轴在衰老和纤维化相关皮肤疾病中具有治疗潜力。

图11 Nefh-Cdk5轴调控谷氨酸释放和胶原稳态

谷氨酸受体和转运体对于谷氨酸的生理功能至关重要。接下来作者探究了是什么介导了谷氨酸对皮肤成纤维细胞的促胶原生成和抗衰老作用。通过小鼠细胞图谱和小鼠皮肤批量RNA测序数据，发现Slc1a3（一种参与细胞激活的谷氨酸转运体）在小鼠皮肤中高表达。为进一步证明Slc1a3主要表达于皮肤成纤维细胞，作者利用PdgfraDreER-tdTomato小鼠标记皮肤成纤维细胞。免疫荧光染色显示，皮肤中大多数Slc1a3⁺细胞为Pdgfra⁺细胞，表明Slc1a3主要表达于小鼠皮肤成纤维细胞。而在衰老小鼠和人类皮肤中Slc1a3均降低，且与年龄呈负相关，提示Slc1a3的缺乏可能导致皮肤衰老过程中成纤维细胞谷氨酸信号传导功能障碍。值得注意的是，在人类皮肤中，SLC1A3表达于大多数与NEFH⁺皮肤神经相接触的PDGFRA⁺皮肤成纤维细胞中。为探究Slc1a3在体内的功能，作者构建了Slc1a3^fl/fl; Col1a2CreER小鼠，实现成纤维细胞中Slc1a3的特异性敲除。与10周龄Slc1a3fl/fl小鼠相比，10周龄Slc1a3fl/fl; Col1a2CreER小鼠皮肤中p16表达升高、胶原蛋白减少，表明成纤维细胞中Slc1a3缺失驱动皮肤衰老。

图12 皮肤成纤维细胞中Slc1a3缺失驱动皮肤衰老

为探究Slc1a3是否介导了谷氨酸对皮肤成纤维细胞的促胶原生成和抗衰老作用，作者用谷氨酸处理10月龄Slc1a3fl/fl和Slc1a3fl/fl; Col1a2CreER小鼠。谷氨酸可增强Slc1a3fl/fl小鼠的胶原生成并抑制成纤维细胞衰老；但在Slc1a3fl/fl; Col1a2CreER小鼠中，谷氨酸无法发挥促胶原生成和抗衰老功能。随后，作者用慢病毒敲低人皮肤成纤维细胞中的SLC1A3。在对照组中，谷氨酸可减轻成纤维细胞衰老并增加胶原丰度；而在SLC1A3敲低组中，谷氨酸的抗衰老和促胶原生成效应均被削弱。这表明谷氨酸对皮肤成纤维细胞的促胶原生成和抗衰老作用由Slc1a3介导。这一结果在衰老相关队列（148名受试者）的皮肤进行免疫荧光染色及相关性分析中也得到验证。值得注意的是，在人类皮肤中，SLC1A3大多表达于与NEFH⁺ VGLUT2⁺皮肤神经相接触的PDGFRA⁺皮肤成纤维细胞中。这些发现支持Slc1a3参与Nefh介导的谷氨酸能神经对成纤维细胞衰老的调控，并为皮肤衰老提供了转化医学意义。

图13 Slc1a3介导谷氨酸对皮肤成纤维细胞的促胶原生成和抗衰老作用

综上所述，该研究首次揭示了皮肤内Nefh⁺/Vglut2⁺谷氨酸能神经元通过释放神经递质谷氨酸，直接调控真皮成纤维细胞衰老和胶原蛋白合成的全新机制。研究通过皮肤去神经手术、Nav1.8⁺神经元特异性消融（Nav1.8-DTR/DT系统）及辣椒素受体激动剂（RTX）处理等多种体内模型，证实皮肤去神经可加速皮肤衰老和胶原丢失。机制上，研究发现衰老皮肤中神经丝重链（Nefh）蛋白显著下调，且Nefh主要表达于Vglut2⁺皮肤支配性谷氨酸能神经元。Nefh缺失通过影响Cdk5-Vglut2轴减少谷氨酸释放，进而导致成纤维细胞衰老和胶原合成减少。更重要的是，补充谷氨酸可通过成纤维细胞上的谷氨酸转运体Slc1a3发挥抗衰老和促胶原合成作用，从而改善皮肤衰老表型。此外，Nefh在衰老皮肤中的下调是由E3泛素连接酶Hecw1介导的泛素化降解所致。该研究首次建立了“神经元-谷氨酸-成纤维细胞”这一皮肤衰老调控轴，为衰老相关皮肤疾病提供了全新的治疗靶点，也揭示了外周神经系统调控组织器官衰老的新范式。