病毒选择指南 & FAQ

Q1、慢病毒载体和腺病毒载体，该怎么选？

答：不管是慢病毒载体还是腺病毒载体，都是很好的基因调控工具，各自有自己的优势，主要根据实验目的不同来选择，可以参考以下几个方面来判断：

（1） 插入目的序列的大小：慢病毒载体包装容量在2kb以内可以保证滴度，腺病毒包装容量在5kb以内可以保证滴度；若目的序列大小超过载体容量，滴度则会随着目的序列大小增加而降低；

（2） 是否需要构建稳转细胞株：慢病毒载体可以将外源基因随机整合到目的细胞基因组中并稳定遗传，即可用于构建稳转细胞株，当然做瞬时转染也可以；而腺病毒不整合基因组，只适用于瞬时转染；

（3） 目的细胞类型：像神经细胞、一些原代细胞等感染难度比较大的细胞，且后续无需建立稳转株，推荐使用腺病毒，其感染效率要远高于慢病毒。

Q2：收到病毒后如何保存？

答：收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4 ℃保存，并最好在一周内使用完；如需长期保存，可按需分装好放置于-80 ℃，以避免使用过程中反复冻融；如要置于液氮罐保存则需更换专门的保存管。另外，若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度。

Q3：病毒使用过程中如何进行稀释？

答：需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基（含血清或含双抗不影响病毒感染）混匀分装后置于 4 ℃保存（一周内使用完最佳）。以慢病毒为例：如原病毒标记的滴度为1x10⁸ TU/mL，取10 μL至90 μL到常规培养基中，即可得到1x10⁷ TU/mL滴度的病毒。

Q4：什么是MOI？

答：MOI，感染复数，是指病毒对细胞的感染能力，细胞需要的MOI值越高，证明细胞越难被感染。通常把某株细胞80%被感染时所需要的病毒颗粒数与细胞数目的比值作为该株细胞的MOI值。

相关计算公式：

每孔加病毒量（μL）=MOI × 细胞数 / 病毒滴度（TU/mL或PFU/mL）×1000

MOI=（病毒滴度 × 病毒体积）/ 细胞数

Q5：用于病毒感染的细胞接种量是多少？

答：根据细胞大小和增殖的速度调整细胞接种量，以保证在感染后2~3天细胞刚好快长满培养皿底部为宜。针对大部分细胞系：传代周期在2-3天，感染时细胞铺板的密度保持在30-50%左右，则细胞增殖48 h后细胞汇合度约在90%左右；针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到50-60%左右，但要确保在感染后2天细胞汇合度达到90-100%；针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种。

Q6：如何确定向细胞中加入病毒的最佳时间？

答：慢病毒感染细胞后需要48-72 h观察到病毒携带的基因表达，腺病毒感染细胞后需要36-48 h观察到病毒携带的基因表达，应在细胞汇合度30-50%且细胞状态良好时加入病毒。

Q7：对照病毒或目的病毒感染细胞以后，细胞形态发生改变或者细胞死亡？

答：首先，确定细胞或病毒是否有污染；其次，确定病毒感染MOI值是否过高，调整MOI值，并在感染后的4 h、8 h和12 h对细胞进行观察，若发现细胞状态变差时，则需要使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液；排除以上因素后细胞状态仍然不好，尝试增加血清含量，观察细胞状态是否好转。

Q8：如何提高病毒对细胞的感染效率？

答：病毒对细胞的感染效率受多个因素影响，如病毒活性、细胞自身的状态、MOI值、感染时间等。

①病毒活性：解冻病毒一定要在冰上进行，尽量避免反复冻融。-80 ℃保存半年以上需要重新测滴度。

②目的细胞：先进行预实验测试，看病毒载体是否合适感染目的细胞。对于悬浮细胞，可采用平角离心感染的方法，减少病毒感染时的体积，从而提升感染的效率。

③MOI值：进行MOI梯度摸索实验，找出最优的MOI值。

④感染时间：太早换液会导致感染效率下降；换液太晚，则对细胞的损伤较大。若细胞状态比较好，可适当延长换液时间来进一步提高感染效率。

⑤助转剂：可根据情况添加一定浓度的polybrene，不同细胞对polybrene的敏感性不同，可以用1-10 μg/mL 的范围筛选合适浓度，以24 h内细胞无明显毒性反应为佳。

Q9：哪些实验可以选择AAV病毒？

答：AAV病毒时高效的体内基因递送工具，适用于动物体内实验，但因为其容量和表达特性，对于基因较大或者需要感染后快速表达的实验不适合使用AAV，其余情况一般都适用。

Q10：AAV病毒应该如何稀释保存？

答：收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4 ℃保存，并最好在一周内使用完；如需长期保存，可按需分装好放置于-80 ℃，以避免使用过程中反复冻融；如要置于液氮罐保存则需更换专门的保存管。使用过程中如果需要稀释则使用PBS或生理盐水按需进行稀释使用。

Q11：AAV注射小鼠，多少病毒量才够呢？

答：影响AAV注射总量的因素很多，比较重要的有血清型、目标组织类型、注射方式（局部or全身）、动物模型（如大鼠or小鼠）等，对于有文献报道的，可参考文献的注射方法，最好设置几个不同的梯度。例如AAV9感染小鼠心脏组织（心肌细胞），可采用尾静脉注射也可采用心肌多点注射的方式，尾静脉注射推荐10¹¹ vg/mL，100μL；原点注射则推荐10¹² vg/mL，20 μL。

Q12：AAV可以通过哪些方法注射到动物体内进行感染？

答：根据实验感染的具体需求，可以分为系统性给药和局部给药。系统性给药如尾静脉注射，通过血液循环将病毒颗粒递送到全身各处,但这种方法对肝脏感染效果很好，而对其他一些组织和脏器效果欠佳，特别是对脑组织，因为血脑屏障的原因，需要和特异性血清型配合才能通过尾静脉注射实现脑组织感染；二是局部给药，如脑立体定位注射、肌肉注射等这种注射方法可以比较高效地感染局部组织，特异性好，病毒用量也小，但对于一些组织器官的注射需要进行手术或者需要特殊设备，操作难度较大。

Q13：AAV注射动物后多久可以观察病毒感染效果？

答：AAV是单链的DNA病毒，感染到细胞内需要先形成双链形式的附加体才能进行基因表达。在1-2周时目的序列也在表达，但此时处于表达逐渐积累阶段，表达量好较低，所以，一般建议3-4周后检测目的基因表达情况比较稳妥。

Q14：AAV注射后如何检测目的基因过表达？

答：AAV病毒注射3-4周后开始检测，过表达可以通过免疫组化、免疫荧光和wb在蛋白水平上检测，但通常对所使用的抗体要求比较高，为了方便检测，可以在构建过表达载体时在蛋白上融合一个flag表圈，检测时直接通过商业化的flag抗体检测进行检测，也可以通过qpcr直接检测转录水平的变化；对于基因干扰的检测，一般只通过qpcr检测转录水平的下调情况。

Q15：用AAV可以实现组织特异性的感染吗？

答：可以。通过AAV定点注射、特异性血清型可以实现组织特异性的感染，结合特异性启动子，更可以细到特定细胞的特异性表达调控。