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CRISPR-Cas9系统是基于原核生物适应性免疫机制改造的基因编辑技术。其包含两个模块，一是识别特异DNA序列的gRNA及其骨架，二是结合和编辑DNA的蛋白质Cas9。自被发明以来，该技术快速发展，目前CRISPR-Cas9及其变体已经被广泛应用于活细胞内核酸的编辑、检测、标记、成像等各个领域。由于其在不同物种中所展示出的高效易用的特点，该技术已经革新了基础生命科学和生物医学的研究方式。该技术的发明人也被授予了2020年诺贝尔化学奖。如今CRISPR-Cas系统仍在蓬勃发展，无论在基础科学研究领域还是在基因治疗、细胞治疗等临床应用领域都具有广泛的前景和深厚的潜力。
汉恒生物所有的敲除单克隆都通过构建T载体进行测序验证，清晰看出DNA序列的具体变化，确保敲除性状稳定不恢复。
CRISPR/Cas 系统全称为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)。这一系统是源于细菌中的一种后天免疫系统（图1）。该系统可以把侵入细菌的噬菌体遗传物质整合到自身基因组一个或者多个CRISPR位点作为永久的“记忆”，当细菌被再次入侵的时候，CRISPR 位点被转录生成 CRISPR RNAs（crRNAs)。crRNA 随后会引导 DNA剪切酶 Cas9 根据序列互补的原则剪切入侵的外源核酸序列，消灭外来遗传物质，发挥保护功能（图2）。简而言之，源于 CRISPR/Cas 系统的基因组编辑技术被工程化为一段介导定位作用的 RNA 序列（guide RNA和crRNA合二为一的杂合RNA序列，称为sgRNA）加上一个DNA水解酶Cas9组成的二元系统。
研究者把这一系统工程化成可以用于编辑哺乳动物细胞的CRISPR/Cas9系统。具体包括适于哺乳动物表达的 Cas9 基因和定位作用的 sgRNA（图3）。方便起见，研究者把这两者放在了一个载体之中（all in one plasmid）。如果计划利用这一系统编辑某个目的基因，我们唯一要做的就是定制一条有效的sgRNA。
图1 CRISPR/Cas 系统来源于细菌的“免疫系统”
图2 细菌利用 CRISPR/Cas 系统攻击噬菌体入侵示意图
图3 工程化的 CRISPR/Cas 系统。该系统是个二元系统：负责切割的 Cas9 核酸酶和定位用的 guide RNA （sgRNA）
我们一般将感染后经过筛选的细胞称为稳转株，也就是混合克隆细胞株。混合克隆细胞株虽然可以表达目的片段，但不同克隆（细胞）的目的基因整合位置和表达量均有所不同。
而单克隆细胞株是从混合克隆细胞中经单个细胞增殖所得，即由同一个细胞扩增得到的细胞株。每个细胞的目的基因整合位置以及表达量等特征均高度一致。
一般情况下，混合克隆稳转株即可满足科研需求，比如基因功能初步验证等实验，节省了单克隆化的时间与经济成本。但与单克隆株相比，以此得出的数据稳定性与重复性往往稍差，若想减少实验的波动，提高实验的可重复性，则需要挑选单克隆细胞株。
构建基因敲除细胞系时，往往需要挑取单克隆。
实验室常用的单克隆细胞株挑选方式有三种：
1、有限稀释法，采用梯度稀释原则，将细胞悬液连续倍数稀释至极低密度，接种于96孔板，直至孔中出现单个细胞克隆。
2、平皿克隆分离法，通过在平皿内预置小盖玻片或用金属套环并加消化液达到分离克隆细胞的目的。
3、软琼脂克隆分离法，适用于悬浮细胞。
常见的鉴定方法包括三种：
1，测序鉴定：单克隆直接PCR测序，可以直观看到编辑位点的DNA序列；
2，酶切鉴定：编辑位点跨过某个内切酶位点的可以用PCR-酶切的方法来判断；
3，WB鉴定：用抗体直接鉴定目的蛋白是否消失，如果抗体条带特异，还可以简化为dot blot。
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