AAV-saCas9 在体基因编辑

在体基因编辑是将 CRISPR/Cas9 系统直接递送至活体动物的目标组织，在组织原位完成基因编辑。与构建全身性敲除小鼠相比，在体编辑周期更短、成本更低，并可实现特定组织、特定时点的基因干预。

核心难点在于递送。AAV 是当前在体递送的主力载体之一，具有免疫原性相对较低、不整合、可长期表达等特点，但其包装容量有限，无法容纳 SpCas9 全长。因此，本服务采用更小的 SaCas9，以实现单载体递送。

SaCas9 来源于金黄色葡萄球菌，序列明显短于 SpCas9。将 SaCas9、sgRNA 和短启动子装入单个 AAV 载体（all-in-one），一次注射即可递送完整编辑系统。SpCas9 通常难以单载体包装，需拆分为双载体，两个病毒同时感染同一细胞的概率降低，整体编辑效率可能下降。

SpCas9 识别 NGG，SaCas9 识别更长的 NNGRRT。SaCas9 的 PAM 更长，基因组中可选靶点密度相对较低，但可覆盖部分 SpCas9 不适用的位点。sgRNA 设计阶段需按 SaCas9 的 PAM 特征重新筛选，不沿用 SpCas9 设计。

AAV 不同血清型的衣壳蛋白不同，对不同组织和细胞的亲和性差异显著。血清型选择是在体实验的第一步，也是影响递送效果的关键因素。下表按感染部位整理常用血清型和给药方式，供方案设计参考。

血清型决定病毒更容易进入哪些组织或细胞，属于物理递送层面的效率。若要将表达限定在特定细胞类型，需依赖组织特异性启动子或 Cre 依赖的表达系统。两者可独立选择并叠加使用。

启动子决定目的基因进入细胞后在哪些细胞中表达。使用组织特异性启动子可将表达限定于目标细胞类型，减少非目标细胞中的编辑。研究特定细胞类型中的基因功能时，该步骤尤为关键。

在目标组织中敲除特定基因，研究该基因在整体动物水平的功能。与全身性敲除动物模型相比，在体敲除周期更短、成本更低，并可实现特定组织与特定时点的敲除。

结合 Cre 依赖的表达系统，在特定组织或特定时间点触发编辑。适合研究发育必需基因，或者要规避胚胎致死的情况。项目开始前需明确 Cre 来源与诱导方式。

可在同一载体上串联多条 sgRNA，或分装至多个载体。受 AAV 容量限制，靶基因数量需在方案阶段评估。

给药途径与血清型需联合选择。尾静脉、局部注射、脑立体定位、鞘内、玻璃体腔、滴鼻雾化等不同途径对应的组织分布差异显著，选错后难以通过后续调整弥补。

尾静脉注射，全身性递送，肝脏、心脏、肌肉分布好，操作最简单。

立体定位注射，绕开血脑屏障做局部脑区，需要手术操作。

鞘内注射，主要用于脊髓与背根神经节。

局部多点注射，心肌、骨骼肌原位注射，用量小、局部浓度高。

视网膜下腔 / 玻璃体腔注射，眼科相关研究。

气管内 / 滴鼻 / 雾化，肺脏递送。

AAV 介导的表达起效慢，标准单链 AAV 进入细胞后需完成第二链合成，峰值表达通常需 1–3 周。取样过早可能无法观察到编辑效果，是项目返工的高发环节。具体时长与血清型、启动子、给药剂量相关，详见腺相关病毒操作手册。