荧光素酶报告基因检测服务

pGL3-Basic---用于转录因子结合位点与启动子活性分析。把待分析启动子区段构建到F-Luciferase上游，和转录因子共转染分析F-Luciferase活性即可反应启动子的活性高低。该质粒通常需要结合持续性表达R-Luciferase的载体作为内参以校正不同样品之间转染的转染效率(参考案例一)。

psiCHECK2---miRNA与其靶点相关分析,包括miRNA靶基因验证(参考案例二A和B)、lncRNA (参考案例三)与circRNA (参考案例四)吸附miRNA验证等。需要把miRNA潜在结合靶点克隆到R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR区域，然后与待测miRNA共同转染细胞内测定R-Luciferase活性高低，F-Luciferase （hLuc+）作为校正内参校正不同样品之间转染的转染效率。

LncRNA转录因子结合位点与启动子活性分析

论文来源: Wang, P., et al. (2014). "The STAT3-binding long noncoding RNA lnc-DC controls human dendritic cell differentiation." Science 344(6181): 310-313.

本文是曹雪涛实验室在2014年发表在Science上一篇研究性论文。作者通过芯片鉴定出DC (树突状细胞)发育相关的一个lncRNA，命名为lnc-DC。同时高通量测序也发现了这条差异lncRNA的存在。进而作者通过Northern Blot验证了这条lnc-DC。由于lnc-DC极其特异和稳定地高表达在DC发育过程的某一时期，所以作者假设lnc-DC可能是和表观遗传学调控事件相关的。为了验证这一假设，作者通过染色体免疫沉淀结合测序的技术-CHIP-seq和qPCR发现lnc-DC的转录起始位点（TSS）附近富集了Pol II、H3K4me3和H3K27ac等蛋白（下图A），提示DC发育过程中表观遗传学变化与lnc-DC的转录增强事件相对应。进而作者通过序列分析发现在lnc-DC的转录起始位点附近（+44-+50）存在一个经典的PU.1结合位点。作者假设PU.1参与了lnc-DC的特异性表达。于是作者设计了如下实验进行了进一步的验证（下图B）。

作者把lnc-DC的启动子区段（-1447-+223）及其不同的突变体版本分别克隆到F-Luciferase表达框上游，然后和转录因子PU.1表达质粒或者空载体（Vector）共同转染到模式细胞系HEK-293T，通过测量荧光强度的变化间接反应转录活性的高低。最终证明转录因子PU.1通过经典结合位点（+44-+50）介导了lnc-DC在DC发育过程中的特异表达。

LncRNA通过吸附miRNA调控靶基因mRNA的表达 (ceRNA)

论文来源: Cesana, M., et al. (2011). "A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA." Cell 147(2): 358-369.

作者通过表达分析发现了一条肌肉发育相关的lncRNA---lnc-MD1.前期功能研究发现lnc-MD1可以调控肌肉分化的时间。信息学分析发现这条肌肉特异的lncRNA上包含36个miRNA的结合位点。如果只考虑肌肉发育相关的miRNA和基因，36个候选miRNA里面只剩下miR-133和miR-135。作者通过荧光素酶实验进行了验证。首先作者把野生型及其缺失miR-133和miR-135结合位点的Lnc-DC1克隆到进R-Luc的3’UTR，然后分别与表达miR-133和miR-135前体的质粒共同转染到细胞进行荧光素酶活性检测（下图A和B）。证明lnc-MD1缺失存在miR-133和miR-135的结合位点。

进一步的信息学预测，miR-133和miR-135分别靶向两个基因- MAML1 和 MEF2C。同样，作者还是通过荧光素酶实验进行验证。研究者把MAML1 和 MEF2C的3’UTR （WT）和miRNA结合位点缺失突变体（-mut）分别克隆在RLuc表达框的下游，然后和miRNA过表达载体共转染细胞进行酶活测定。结果显示miR-133和miR-135确实分别靶向了MAML1 和 MEF2C两个基因（下图C）。最后的模型是lnc-MD1通过ceRNA机制吸附miR-133和135，正向调控了MAML1 和 MEF2C的表达，参与调控肌肉发育。

LncRNA通过吸附miRNA调控其生理功能 (ceRNA)

论文来源: Kallen, A. N., et al. (2013). "The imprinted H19 lncRNA antagonizes let-7 microRNAs." Molecular Cell 52(1): 101-112.

H19属于非常保守的印记基因家族，在胚胎发育和生长方面发挥极其重要的功能。为了进一步研究lncRNA H19的功能，作者通过信息学分析发现H19包含let-7的4个结合位点。于是作者推测H19可能会影响let-7发挥作用。

为了验证这一预测，研究者把4个let-7潜在结合位点串联起来克隆到RLuc的3’UTR区。然后先后跟let-7的抑制型载体（下图A和C）和过表达载体（下图B）分别共转染到细胞系检测荧光素酶的活性，证明Let-7的结合位点确实存在且发挥功能。进一步证明H19通过RNA sponge的机制影响let-7家族靶基因的表达参与肌肉发育调控过程。

circRNA通过吸附miRNA调控其生理功能 (ceRNA)

论文来源: Zheng, Q., et al. (2016). "Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs." Nat Commun 7: 11215.

环状RNA (circRNA)是非编码RNA领域一类新的明星分子，研究者对其功能还知之甚少。

本文中，作者鉴定出一个表达量较高的环状RNA分子-circHIPK3. circHIPK3来源于基因HIPK3第二个外显子。RNAi干扰circHIPK3可以影响细胞的生长。为了进一步研究其机制，作者通过序列分析发现circHIPK3含有一些列miRNA结合位点。为了从中筛选出真正的miRNA，作者构建了基于荧光素酶的筛选系统---把circHIPK3构建到Luciferase的3’UTR区域，然后分别与424个miRNA mimics共转染到模式细胞系HEK-293T内进行筛选验证，最终作者筛选出9个候选的miRNA。通过功能试验和共表达分析进一步验证得到mir-124是阳性候选miRNA。最终作者证明circHIPK3通过吸附miR-124正向调控了其靶基因IL6R 和 DLX2的表达，影响了细胞的生长。