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化学修饰的热启动DNA聚合酶，在室温时酶活力被完全抑制，避免非特异性扩增。95oC加热数分钟后抑制失效，Taq酶恢复活力。
SYBR Green I游离状态下几乎无荧光，与双链DNA非特异性结合后产生很强的荧光。反应体系中SYBR Green I的荧光强度，与双链DNA的含量成正比，因此可用于目的基因的定量。
DNA扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光探针与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。
| 染料法 | 探针法 | |
|---|---|---|
| 优点 | 价格便宜 适用性广 可借助熔解曲线或凝胶分析产物特异性 |
特异性好 灵敏度高，适合低丰度基因定量 |
| 缺点 | 特异性稍差 引物要求高 |
价格贵 只适合特定目标 |
| 应用 | 科研中多个基因定量分析，表达量研究等 | 病原体检测，疾病耐药基因研究，药物疗效分析，遗传疾病诊断 |
*本产品使用的为染料法。
| 试剂 | 使用量 |
|---|---|
| HBStart Green qPCR Premix | 5 μL |
| 正向引物（10 μM） | 0.4 μL |
| 反向引物（10 μM） | 0.4 μL |
| DNA 模板 | X μL（推荐 1～2 μL） |
| Nuclease-Free Water | 补足至10 μL |
两步法
| 步骤 | 温度 | 时间 |
|---|---|---|
| 预变性 | 95℃ | 30sec |
| 变性 | 95℃ | 10sec |
| 退火&延伸 | 60℃ | 30sec （40 Cycles） |
| 熔解曲线 | 使用仪器默认采集程序 | |
三步法
| 步骤 | 温度 | 时间 |
|---|---|---|
| 预变性 | 95℃ | 30sec |
| 变性 | 95℃ | 10sec |
| 退火 | 55～65℃ | 10sec （40 Cycles） |
| 延伸 | 72℃ | 30sec |
| 熔解曲线 | 使用仪器默认采集程序 | |
扩增曲线不光滑
可能原因：荧光信号太弱，经系统校正后产生
解决办法：确保Mix中预混的染料未降解；更换荧光信号收集更好的qPCR专用耗材。
扩增曲线断裂或下滑
可能原因：模板浓度较高，基线的终点值大于Cq值
解决办法：减小基线终点（Cq值-4），重新分析数据。
个别孔扩增曲线突然骤降
可能原因：反应管内留有气泡
解决办法：确保Mix完全溶解，请勿涡旋振荡混匀；加样完成后轻弹离心去除气泡；延长预变性时间至10 min，以去除气泡。
反应结束无扩增曲线出现
可能原因：反应循环数偏少
解决办法：设置循环数为40，但更多的循环数会增加过多的背景信号。
可能原因：荧光信号采集步骤未设置或者设置错误
解决办法：两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火&延伸阶段，三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
可能原因：引物可能降解
解决办法：长期未用的引物，应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除其降解的可能。
可能原因：模板浓度过低
解决办法：减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起。
可能原因：模板降解
解决办法：重新制备模板，重复实验。
Cq值出现过晚
可能原因：扩增效率低
解决办法：提高引物浓度，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物。
可能原因：模板浓度过低
解决办法：减少模板稀释倍数重复实验，样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起。
可能原因：模板降解
解决办法：重新制备模板，重复实验。
可能原因：扩增产物过长
解决办法：扩增产物长度控制在80～200 bp。
可能原因：体系中存在PCR抑制剂
解决办法：一般为模板带入，加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验。
空白对照出现信号
可能原因：反应体系污染
解决办法：首先更换空白对照的水，如果还发生同样情况，继续更换引物、吸头、PCR管或启用新的Mix；反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
可能原因：出现引物二聚体等非特异性扩增
解决办法：一般在35循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况，应配合熔解曲线进行分析；重新设计引物，调整引物浓度或优化PCR反应程序。
熔解曲线出现多峰
可能原因：引物设计不佳
解决办法：根据引物设计原则重新设计新引物。
可能原因：引物浓度过高
解决办法：适当降低引物浓度。
可能原因：cDNA模板存在基因组污染
解决办法：提取后的RNA溶液使用DNA酶进行消化，例如：dsDNase，以去除基因组污染，或设计跨内含子引物。
实验重复性差
可能原因：加样误差大
解决办法：使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液；高倍稀释模板，加入大体积模板减少加样误差；放大qPCR反应体积。
可能原因：模板浓度过低
解决办法：减少模板稀释倍数重复实验。
可能原因：qPCR仪不同位置的温度偏差
解决办法：定期校准qPCR仪。
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