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转染试剂系列

Transfection Reagent

细胞转染实验即将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术，是分子生物和细胞生物学最常见的实验技术。将外源DNA 导入哺乳动物细胞的方法大致可分为两大类，即生物方法和物理化学方法。物理化学方法中常用的有磷酸钙法、显微注射、电穿孔、脂质体介导的转染，以及最近出现的以高分子聚合物为载体的基因传递技术。生物方法则主要是以病毒作为载体,通过病毒感染的方式将外源DNA 导入到细胞中, 其中以慢病毒及腺病毒转染系统最为常用。

汉恒生物提供用于 DNA、siRNA、RNA 递送的多种转染试剂。

汉恒转染试剂特点：

高效性

转染效率高，适用于大多细胞系

低毒性

转染的细胞仍保持很好的活性

广普性

普通细胞、难转染的原代细胞全面覆盖

细胞转染试剂产品列表：

产品货号	产品名称	产品规格	适用范围
HB-LF-1000	LipoFiter转染试剂	1mL	适用于普通细胞系转染，低细胞毒性
HB-LF3-1000	LipoFiter 3.0高效转染试剂	1mL	适用于普通细胞系和难转染细胞系，转染效率高
HB-RF-1000	RNA转染试剂RNAFit	1mL	适用于小RNA转染
HB-LLF-1000	LentiFit慢病毒包装专用转染试剂	1mL	适用于慢病毒包装共转染慢病毒质粒系统

细胞转染方法比较：

转染方法	原理	应用	特点
脂质体转染	阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞	瞬转/稳转	实验操作简单，重复性高，细胞毒性低，适用性广
磷酸钙法	磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞	瞬转/稳转	实验条件控制严格，难度较大，且不适用于原代细胞
病毒转染	利用病毒携带目的基因片段，感染目的细胞，主要有慢病毒、腺病毒和腺相关病毒	瞬转/稳转	转染效率高，可用于难转染的细胞及原代、悬浮细胞，病毒包装难度较大
电穿孔法	电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使DNA分子进入胞内	瞬转	适用性广，但细胞致死率高，DNA和细胞用量大
显微注射	使用一根超细的针头讲DNA,RNA或蛋白直接注入细胞质或细胞核	瞬转/稳转	适用这种方法的细胞不多，技术复杂设备昂贵

常见问题

细胞转染试剂怎么选？

我们公司有各种不同的转染试剂可供大家实验需求。针对siRNA的转染可以选择RNA专用转染试剂RNAFit。针对质粒DNA的转染可以选择LipoFiter转染试剂，改转染试剂适用于普通细胞系转染，具有低细胞毒性的特点。高级版的LipoFiter 3.0高效转染试剂，适用于普通细胞系和难转染细胞系，具有极高的转染效率。如果有慢病毒包装的实验需求，可以选择LentiFit慢病毒包装专用转染试剂，配合我们的慢病毒包装系统，可以获得高滴度的病毒液。

转染前细胞需要怎样的状态和密度呢？

细胞的生长状态会直接影响转染效果。转染前细胞最好经过1-2次传代，细胞良好的生长状态有助于提高转染效率。有些细胞系传代很多次还能够保证很高的转染效率，而其他一些细胞系则传代很少次数转染效率就有显着降低，值得注意的是，贴璧细胞一旦长满就不容易转染了。用于转染的细胞密度根据不同的细胞类型而异。细胞密度对转染效率的影响比较大。一般在转染时，贴璧细胞密度50%~70%为宜，悬浮细胞密度为2x 10^6--4x 10^6细胞/ml时效果较好。铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量，对于转染siRNA确保接种贴璧细胞密度在30%-50%左右，悬浮细胞密度为5x 10^5--1x 10^6细胞/ml，对于一些生长缓慢的细胞，接种密度可适当扩大2倍。

转染时是否需要使用无血清、双抗的培养基？

血清一度曾被认为会降低转染效率，在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基。血清中含有大量的蛋白质，在转染过程中，带负电的蛋白质可能干扰阳离子脂质体/阳离子聚合物对核酸的吸附，影响转染效率。但在复合物形成后，在加入细胞中前可以加入血清。当然，最好是按照转染试剂说明书的要求来进行操作。双抗一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使双抗可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用双抗，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用双抗。

转染效率低的原因是什么呢？

影响转染效率的因素主要有以下几点；细胞因素，细胞的状态对转染效率的影响较大。要确保细胞未被污染以及细胞处在对数期。如果是贴壁细胞的话，贴壁率应该在50%~70%。转染时细胞密度过高或者过低都会导致转染效率降低，乃至表达水平偏低。核酸因素，转染载体的质量也影响转染结果。如果DNA 不纯，OD260/OD280<1.6，表示存在蛋白或者酚类污染，会影响核酸-转染试剂复合物的形成，从而降低质粒的转染效率。质粒抽提过程中如果存在内毒素会影响到细胞状态甚至导致细胞死亡，建议用无内毒素质粒抽提试剂盒进行质粒提取。转染条件，是否是最优转染条件进行转染。正式实验前，一般需要根据说明书，设置一系列梯度对核酸/转染试剂比例进行摸索，选择最佳组合作为后续转染条件。

转染后出现细胞死亡是什么原因？

可能是细胞本身状态差，在进行转染实验刺激后也可能导致细胞死亡。应该在转染前调整好细胞状态，在转染实验过程中操作尽可能小心，减少实验操作对细胞造成不必要的损伤。用于转染的质粒DNA如果不纯，比如含有蛋白质、酚等污染，在进行细胞转染过程中进入细胞后也会影响到细胞的生长状态甚至导致细胞死亡。如果转染用的质粒含有内毒素，也会对细胞造成较大的毒性。

应用案例：

客户案例1：

中国农业大学客户发表于Molecular Cancer，IF=41.444

文章标题：A novel polypeptide encoded by the circular RNA ZKSCAN1 suppresses HCC via degradation of mTOR

使用方法：LipoFiter 3.0转染质粒

细胞转染试剂

文章figure2 circZKSCAN1编码一个206aa的多肽

客户案例2：

江苏大学医学院客户发表于Molecular Cancer，IF=41.444

文章标题：Tumor-derived exosomes induce N2 polarization of neutrophils to promote gastric cancer cell migration

使用方法：LipoFiter转染siRNA到BGC-823细胞

文章figure7 HMGB1在胃癌细胞中被沉默 siRNA

感染效果：

客户发表文献节选：

Tumor-derived exosomes induce N2 polarization of neutrophils to promote gastric cancer cell migration

（杂志:Molecular Cancer，IF=27.401，江苏大学医学院）

Low expression of TRAF3IP2-AS1 promotes progression of NONO-TFE3 translocation renal cell carcinoma by stimulating N6-methyladenosine of PARP1 mRNA and downregulating PTEN

（杂志:Journal of Hematology and Oncology，IF=17.384，南京大学）

Switch receptor T3/28 improves long-term persistence and antitumor efficacy of CAR-T cells

（杂志:Journal for ImmunoTherapy of Cancer，IF=13.751，山东大学）

Positive natural selection of N6-methyladenosine on the RNAs of processed pseudogenes

（杂志:Genome Biology，IF=13.583，中山大学）

TRIM24 facilitates antiviral immunity through mediating K63-linked TRAF3 ubiquitination

（杂志:Journal of Experimental Medicine，IF=11.743，中国科学院上海营养健康研究所）

Targeting miR-21 with NL101 blocks c-Myc/Mxd1 loop and inhibits the growth of B cell lymphoma

（杂志:Theranostics，IF=11.556，浙江大学医学院第二附属医院）

Tubular epithelial cell-to-macrophage communicationforms a negative feedback loop via extracellular vesicletransfer to promote renal inflammation and apoptosis indiabetic nephropathy

（杂志:Theranostics，IF=11.556，安徽医科大学）

N6-methyladenosine-induced circ1662 promotes metastasis of colorectal cancer by accelerating YAP1 nuclear localization

（杂志:Theranostics，IF=11.556，郑州大学第一附属医院）

Tubular-specific CDK12 knockout causes a defect in urine concentration due to premature cleavage of the slc12a1 gene

（杂志:Molecular Therapy，IF=11.454，东南大学医学院中大医院）

A novel epigenetic AML1‐ETO/THAP10/miR‐383 mini‐circuitry contributes to t(8;21) leukaemogenesis

（杂志:EMBO Molecular Medicine，IF=10.624，中国人民解放军总医院）