理论上来说应该避免冻结，因为冰晶的形成会破坏脂质体的结构，从而影响其转染效率。但是具体影响有多大，可以转一个带荧光的质粒预实验试一下看看的。
miRNA做干扰有2种方式，分别为 antago 与 sponge，两种方式都是通过利用 microRNA 的互补序列对 microRNA 的功能进行封闭。
Antago 只有一条 mir 的互补序列，而 sponge 一般为四条 mir 的互补序列串在一起，对 microRNA 的封闭效果相对更好。
mimics和agomir用于miRNA过表达； inhibitor和antagomir用于miRNA干扰，四者都是化学合成的。
Mimics（双链）：针对 miRNA 的成熟体设计并合成的小片段双链 miRNA，作用与 miRNA 的成熟体一样。
Agomir（双链）：在 mimics 基础上，经过特殊化学修饰（反义链进行修饰，3’端进行胆固醇修饰，5’端两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰）的升级产品，更稳定，表达时间更长，无需转染试剂，可直接溶解后用于动物实验。
Inhibitor（单链）：
为什么相同感染条件下，目的病毒的荧光比对照病毒的要弱一些？
我要做一个过表达慢病毒，可以再单独过表达3*Flag作为对照吗？
只有慢病毒可以构建稳转株吗？质粒不行吗？
细胞中同时转染2个质粒，需要怎么操作？
VP（viral particles）反映病毒颗粒的总数（包括活性病毒和非活性病毒），由于在病毒制备过程中，每次活性病毒和非活性病毒的比率都不同， VP并不能反映有活性的病毒数量。
PFU（plaque formation unit）代表可感染的活性病毒的数量，能反映实验中所需要病毒的量。
IFU（infectious unit）相当于PFU。
应用VP作为检测病毒数目的单位会与实际应用的活性病毒的数量有很大出入，而用IFU或者PFU会得到比较一致的结果。
腺病毒免疫原性高，用于体内动物实验，更建议纯化腺病毒Ad。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的 fiber 和penton 蛋白（细胞毒素）、介质、血清以及细胞碎片，如果病毒被注入动物体内，这些成分会引起强烈的免疫反应。
根据我的经验有以下几个原因：
（1）细胞可能被污染了，若发现早可根据具体污染的类型加入抑制污染剂及时补救；
（2）载体在抽提过程中，未进行去内毒素处理，转染进细胞后，产生毒性，导致细胞死亡，建议重新用去内毒素试剂盒抽提质粒；
（3）在转染前，细胞汇合率过高，使得培养基中营养物质耗尽，而代谢废物过多，从而导致细胞活性降低而死亡，建议如果不严重的话，在培养皿中补充新鲜培养基，若严重的话要重新铺细胞进行转染。
三种阴性对照的作用如下：
（1）阴性对照siRNA：
siRNA阴性对照（siRNA NC）组，siRNA 阴性对照不靶向任何基因，作为目的基因siRNA组的严格对照组，用于说明 siRNA 作用特异性。
（2）CY3或FAM标记阴性对照siRNA：
带荧光标记的siRNA阴性对照组，与阴性对照siRNA组的区别只在于带有荧光标记，用于指示转染效率，建议最好每一次实验都包含该组。（CY3：激发光550nm，发射光570nm；FAM：激发光492nm，发射光518nm。）
（3）RNAi阳性对照siRNA：
为什么我包装出来的慢病毒的滴度次次都不一样？
用siRNA做基因干扰，为什么要强调mRNA水平检测？可以直接检测蛋白和功能吗？
我想构建稳转株，但是听说有单克隆细胞株和多克隆细胞系，这两个有什么区别？
冻存后的细胞复苏了，但是为什么一直不贴壁？要怎么解决？
化学合成的siRNA 是双链小分子RNA；mimics也是双链小分子RNA；inhibitor是单链小分子RNA。一般我们在公司订购合成后，拿到的是干粉形式，常温运输，收到后我们先进行瞬时离心（如：速率1000rpm）沉淀下来干粉再使用无RNA酶的水进行溶解，溶解后可根据使用量分装，-20℃保存。
根据我的经验来说，我觉得有以下几个原因可参考：
①有些蛋白半衰期长，即使干扰也不一定能被很快降低，可以检测不同时间的比较看看；
②部分蛋白在胞内的翻译有一定效率，干扰降低mRNA，细胞可能进一步提高翻译的效率，导致蛋白受到的影响没有mRNA那么直接；
③蛋白在胞内有一定的代谢率，且是可变的，当表达减少，胞内蛋白降解效率也可能反向调节。
用mt-keima腺病毒感染细胞后观察线粒体自噬，这个建议直接将细胞铺到玻底/共聚焦培养皿中，后续成像需要在活细胞中进行，mt-keima不适合固定的细胞样品，因为固定会破坏溶酶体膜上的pH梯度而影响我们对自噬情况的观察的！
换液后直接加入新鲜完全培养基即可，不需要用PBS wash细胞。
我想通过荧光共振能量转移技术（FRET）验证两个蛋白的互作关系，这两种荧光该怎么选择？
我转染了带荧光标记的siRNA，为什么对照组和实验组的siRNA在荧光显微镜下都看不到光？
我想过表达SELENOP这个基因，但是为什么从NCBI下载的CDS序列中间有很多终止密码子，这还能正常表达这个蛋白吗？
我有一个验证过的有编辑效率的gRNA，之前一直在细胞上做实验的，效果很好，现在想把这个gRNA包成AAV，注射Cas9基因小鼠可以吗？
+ -的话，其实就是多克隆位点的顺序，可以结合质粒图谱看下，-的只不过是把+的多克隆位点反过来了~
不用和其它细胞分开培养箱放的；感染操作在安全柜进行即可，操作完后酒精喷下操作台擦拭干净即可。
可以的，不过需要注意的是：染目的基因抗体的话，这个基因内源外源都表达，看不出来转染效率的；但是如果带标签的话可以染标签抗体，只看外源的，不过对照组就染不出来了因为对照组没有标签蛋白的表达。
可以离心的，病毒液在冰上或者4℃化冻后，可以离心甩一下（离心不用太高速，就是低速甩下就好），然后用枪轻轻吹匀即可。
为什么做质粒转染的时候建议用无血清、无双抗的培养基？
我想在你们这做一个基因敲除单克隆株，但是敲除之后细胞会不会不生长啊？
如果订购的siRNA量比较多，一次性用不完，可以用RNase free水稀释成高浓度的母液进行分装，-20℃或-80℃冷冻保存，使用时可以取需要的量用PBS或生理盐水进行稀释后使用；如果订购的量一次可以直接用完，冻干粉可以-20℃或-80℃保存，现用现PBS或者生理盐水稀释即可。